Abstract FR:

La purine-cytosine permease est un transporteur secondaire specifique des bases puriques et de la cytosine, localise dans la membrane plasmique de saccharomyces cerevisiae. Ce transport utilise comme source d'energie, la difference electrochimique en protons generee par l'atpase plasmique. L'etude biochimique du mecanisme de transport de cette permease implique sa purification. Ainsi dans le but de reperer le transporteur et le suivre au cours de son isolement, un marquage specifique de la proteine a ete entreprise. Nous disposons pour cette etude de trois souches: une souche sauvage, une souche mutante dont le gene codant pour la permease a ete delete et une deuxieme souche mutante, dans laquelle un plasmide multicopie contenant le gene de la permease a ete clone. Les caracteristiques cinetiques de transport sont determinees pour ces trois souches. Trois moyens ont ete mis au point pour marquer la permease: la fixation specifique de ligands, l'utilisation d'anticorps diriges contre les peptides constitutifs des extremites n et c terminales, et un marqueur covalent de photoaffinite: la 8-azido-adenine. La 8-azido-adenine est un inhibiteur competitif de l'activite de transport. Apres irradiation, il se fixe de facon covalente sur les cellules et cette fixation entraine une inactivation du transport en relation avec la quantite de reactif fixe. Ainsi par mesure du marquage specifique de la 8-azido-2#3h-adenine, le nombre de permeases existant dans les cellules et dans les membranes plasmiques a ete evalue pour les differentes souches. Puis l'identification et la caracterisation de la permease ont ete entreprises a partir de preparations enrichies en membranes plasmiques. Pour ce faire des techniques electrophoretiques et de permeation de gel en hplc et de fplc ont ete utilisees. Le polypeptide specifiquement marque par la 8-azido-adenine et specifiquement reconnu par les anticorps a une masse moleculaire apparente de 45 kda en sds-page