Fonction et interactions de la protéine lyst, responsable du syndrome de Chediak Higashi
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Paris 5Disciplines:
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Abstract EN:
The Chediak Higashi syndrome (CHS) is an autosomic recessive disorder, which associates partial albinism with severe immune dysfunctions including a defective cytotoxic activity of T lymphocytes and NK cells. The occurrence of an uncontrolled activation of lymphocytes and macrophages, known as « accelerated phase » of the disease, determines the vital prognosis of the patient. The hallmark of this disease is the presence of giant cytoplasmic granules or organelles in most cell types. The mutant gene, identified in 1996, codes for the cytosolic LYST protein (for Lysosomal Trafficking Regulator), which is defined as a vesicle-trafficking regulatory protein, but whose precise function remains unknown. The main goal of this doctoral work was to try to better understand the role of the LYST protein, responsible for the Chediak Higashi syndrome, in the cell and to identify new partners of this protein. In this purpose, two main research aims have been developped. The first aim is based on the structural analysis of the protein. LYST is a 425kDa cytosolic protein and belongs to the BEACH family (Beige and Chediak Higashi) which is composed of various large-sized proteins sharing the three same C-terminal domains (a pleckstrine homologous PH domain, followed by the BEACH domain and finally by WD40 repeats). Noticeably, the knowledge of the sequence of LYST was relatively unrevealing. Indeed, its N-terminal 2/3 part forms an orphan sequence within which no canonical motifs with assigned function could be found. To progress in the functionnal characterization of LYST, a fine structural study was performed with the group of Isabelle Callebaut and Jean-Paul Mornon (IMPMC, CNRS UMR 7590) which lead us to the identification of a new concanavalin-A lectin domain in the LYST protein. This data helps opening new perspectives regarding the potential role of LYST in the cellular machinery. On the other hand, the search for missense mutations in patients expressing a mild form of the disease allowed us to point out some functionnally critical residues of the protein. The second aim of our research has tried to better characterize the consequences of a LYST defect in the intracellular vesicular trafficking. We questionned the nature of the giant granulation in CHS cytotoxic cells ; this compartment contains the store of perforin (the lytic protein specific of cytotoxic granules), carries the LAMP molecule (characteristic for late endosomes and lysosomes) and its generation seems to occur at the very end point of the endocytosis pathway. Moreover, we highlighted in these lymphocytes an abnormal fusion of endosomal compartments involved in the formation of the « exocytic vesicles », which are necessary to the terminal maturation of cytotoxic granules. The study of three main intracellular vesicular trafficking pathways involving the endosomal network has allowed us to show an impairment of the degradative ESCRT-mediated pathway (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) in CHS patient fibroblasts. The physiological importance of this pathway and its involvment in various cellular processes just begins to be figured out. Our results support a primary role of LYST in endosomal biogenesis which affects the terminal maturation of secretory lysosomes.
Abstract FR:
Le syndrome de Chediak-Higashi (CHS) est une maladie rare, de transmission autosomale récessive, qui associe un albinisme partiel et une pathologie immunitaire sévère, associée notamment à une activité cytotoxique des lymphocytes T déficiente. L’apparition d’une activation exagérée et incontrôlée des lymphocytes et des macrophages, connue sous le nom de « phase accélérée » de la maladie, détermine le pronostique vital du patient. La caractéristique la plus remarquable de cette maladie est la présence de granules cytoplasmiques géants dans la plupart des types cellulaires. Le gène responsable, identifié en 1996, code pour la protéine cytosolique LYST (pour Lysosomal Trafficking Regulator), à laquelle on attribue de manière générale un rôle dans la régulation du trafic vésiculaire, mais dont la compréhension moléculaire reste encore à ce jour très limitée. L’objectif des présents travaux doctoraux est de chercher à mieux appréhender le rôle de la protéine LYST, causative du syndrome de Chediak Higashi, dans la cellule et d’identifier de nouveaux partenaires de cette protéine. Dans ce but, deux axes principaux de recherche ont été développés. Le premier axe intéresse l’analyse structurale de la protéine. LYST est une protéine cytosolique de 425 kDa et appartient à la famille BEACH (Beige and Chediak Higashi), qui comprend un éventail de protéines de taille importante ayant en commun la même architecture C-terminale (un domaine homologue à la pleckstrine PH, suivi d’un domaine BEACH et enfin de motifs WD40 répétés). De manière surprenante, la connaissance de la séquence de LYST a peu apporté à la compréhension de la fonction de cette protéine. Les 2/3 N-terminaux de LYST forment une séquence orpheline, sans motifs canoniques reconnaissables qui permettraient de lui attribuer une fonction propre. Afin de progresser dans la caractérisation fonctionnelle de cette protéine, une étude structurale fine réalisée avec le groupe de Jean-Paul Mornon et d’Isabelle Callebaut (IMPMC, CNRS UMR 7590) nous a permis d’identifier un nouveau domaine lectine au sein de LYST qui ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de cette protéine dans la cellule. D'autre part, la recherche de mutations faux-sens chez des patients présentant une forme modérée du syndrome nous a permis de désigner plusieurs résidus fonctionnellement importants. Le second axe de recherche vise à caractériser plus directement les conséquences d’un défaut de LYST dans le trafic vésiculaire intracellulaire. Nous avons questionné la nature de la granulation géante présente dans les cellules cytotoxiques de patients CHS ; ce compartiment contient la perforine (protéine lytique spécifique des granules cytotoxiques), exprime la molécule LAMP (caractéristique des endosomes tardifs et des lysosomes) et sa génération semble intervenir au point terminal de la voie d’endocytose. De plus, nous mettons en évidence dans ces lymphocytes une fusion anormale de compartiments endosomaux impliqués dans la formation des « vésicules d’exocytoses », nécessaires à la maturation terminale des granules cytotoxiques. L’étude de certaines voies du trafic vésiculaire intracellulaire impliquant le réseau endosomal nous a permis de montrer une perturbation de la voie de dégradation des protéines ubiquitinilées médiée par les ESCRTs (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) dans les fibroblastes de patients CHS. L’importance physiologique de cette voie des ESCRTs et son implication dans divers processus cellulaires commencent tout juste à être cernées. Nos résultats favorisent un rôle primaire de LYST dans la biogénèse du compartiment endosomal qui affecte la maturation terminale des lysosomes sécrétoires.