Abstract FR:

Les phosphatases alcalines sont des enzymes (e. C. 3. 1. 3. 1) homodimeriques d'environ 500 acides amines, produites des bacteries jusqu'aux mammiferes. Elles catalysent a ph alcalin l'hydrolyse non specifique des monoesters de phosphate (rop), selon le mecanisme suivant : e+rop<>e. Rop<>ep+ro<>e. P<>e+p. Les phosphatases alcalines de mammiferes sont connues pour etre les plus actives. La phosphatase alcaline de e. Coli, qui partage 25-30% de residus communs avec ces dernieres, se caracterise par une activite catalytique beaucoup plus faible (k c a t = 65-80s 1 contre k c a t =3000-3500s 1) mais par une thermostabilite remarquable (t m = 95\c contre t m = 67\c). Notre objectif a consiste a augmenter l'activite catalytique de l'enzyme bacterienne par ingenierie tout en preservant sa thermostabilite naturelle. Dans la premiere partie, nous decrivons la strategie de mutagenese que nous avons appliquee a l'enzyme bacterienne. Cette strategie a conduit a l'isolement d'un variant 40 fois plus actif que l'enzyme sauvage (k c a t = 3200s 1) et tres thermostable (t m = 87\c) : il est porteur des substitutions d153g et d330n, l'une localisee au sein du site actif, l'autre en dehors du site actif. Dans la deuxieme partie, nous avons procede a l'etude structurale du variant par cristallographie aux rayons x pour comprendre l'effet de la double substitution sur le mecanisme catalytique. Nous avons etabli sa structure a la fois sous sa forme libre et en exces de phosphate (produit de la reaction), respectivement a 2,4a et 3,1a de resolution. Les resultats suggerent que l'etape e. P<>e+p, qui correspond a l'etape limitante chez l'enzyme sauvage, est tres acceleree, si bien que la transition ep<>e. P devient l'etape limitante. En outre, le variant genere constitue un candidat interessant pour des applications biotechnologiques variees, qui connaissent deja un debut de realisation industrielle.