Abstract FR:

L'objectif de ce travail etait d'etudier une nouvelle polysaccharide hydrolase debranchante qui pourrait etre utilisee en combinaison avec une enzyme depolymerisante pour la bioconversion de son et de paille de ble. Les residus arabinose substitues sur le squelette des xylanes sont connus pour limiter l'action de certaines endoxylanases. C'est le cas de l'endoxylanase a de t. Xylanilyticus d3, une enzyme qui represente l'outil principal de la procedure de bioconversion enzymatique developpee dans notre laboratoire. Afin d'ameliorer cette procedure, nous avons isole et etudie une deuxieme hemicellulase, une -l-arabinofuranosidase (abfd3) qui est capable de liberer des residus arabinose a partir d'arabinoxylanes. En collaboration avec l'equipe du professeur ian connerton (nottingham, angleterre), le gene codant l'abfd3 a ete isole et clone dans un vecteur d'expression de e. Coli. Cette construction genetique a permis la surexpression de l'enzyme recombinante. La proteine a ete isolee et purifiee jusqu'a homogeneite afin de determiner ses principales proprietes. Son optimum d'activite est situe a 75\c, entre ph 5. 6 et 6. 2. L'abfd3 recombinante possede une activite specifique tres elevee comparee a d'autres arabinofuranosidases decrites jusqu'alors. Elle est active sur deux substrats aryles (le pnp--l-arabinofuranoside et le pnp--d-xylopyranoside), ainsi que sur oligo- et polysaccharides. L'enzyme recombinante a revele une grande stabilite dans des conditions de temperature et de ph extremes. D'autre part, nous avons mis en evidence chez cette enzyme une activite de transglycosylation qui permet la synthese d'arabino- et de xylooligosaccharides. L'abfd3 a montre une tres grande specificite pour les arabinoxylanes, ce qui constituait un atout indispensable en vue d'une application potentielle de cette enzyme pour la bioconversion d'agro-ressources. L'abfd3 agissait en synergie avec l'endoxylanase a pour l'hydrolyse du son et de la paille de ble. En effet, l'utilisation des deux enzymes en combinaison a permis de liberer 10 et 15% de l'arabinose total contenu dans la paille et le son de ble respectivement, et a permis d'ameliorer de maniere quantitative les rendements en xylobiose et xylotriose. Cependant, cette action synergique n'a pas conduit a une augmentation significative des rendements d'hydrolyse totaux (produits solubilises). Afin de caracteriser le mecanisme catalytique de l'abfd3, nous avons utilise une strategie basee sur la technique de mutagenese dirigee, pour substituer plusieurs residus carboxylates conserves. L'etude cinetique des mutants de l'abfd3 nous a permis d'identifier les deux residus catalytiques de cette glycosyl-hydrolase de retention : e176, le catalyseur acide/base et e298, le catalyseur nucleophile. D'autre part, nous avons montre l'importance d'un troisieme residu glutamate, e28. Ce residu, critique pour l'activite de l'abfd3 ne serait pas directement implique dans la catalyse enzymatique mais qui jouerait un role dans la stabilisation du complexe glycosyl-enzyme. Les resultats de cette analyse de mutagenese representent la premiere etude de ce type sur une -l-arabinofuranosidase. Ils sont coherents avec l'hypothese que les enzymes de la famille 51 appartiennent a la superfamille 4/7 des glycosyl-hydrolases et indiquent donc que l'abfd3 devrait posseder une architecture moleculaire en tonneau (/) 8.