Abstract FR:

Les nitrile hydratases (nhases) sont des enzymes qui catalysent l'hydratation des nitriles en amides. Leur site actif possede un centre metallique non heminique (co i i i ou fe i i i) coordonne par une sequence de six acides amines cys-ser-cys-x-y-cys et caracterise par un etat bas spin et une absorption a 700 nm. On distingue deux formes de nhases, une forme inactive nitrosylee stable (photosensible et reactivable par la lumiere) et une forme active non nitrosylee, beaucoup moins stable qui necessite la presence d'acide butyrique comme stabilisant. En 1997, la structure aux rayons x de la forme inactive a ete resolue revelant un mode de coordination atypique du fer. Ce dernier est chelate par deux ligands n-amide (liaison peptidique), trois atomes de soufre (cysteines) a des degres d'oxydation differents (thiolate, sulfenate so et sulfinate so 2) et un ligand nitrosyl. Dans le cas de la forme active, l'etat d'oxydation reel des soufres n'est pas connu et le sixieme ligand axial no est remplace par un ligand aquo ou hydroxo. Dans un premier temps, nous avons montre par une approche chimique, que des complexes de fe(iii) issus de ligands n 2s 2 ou n 3s 2 de type amine-thiolate ne parviennent pas a reproduire les proprietes de l'enzyme. Afin d'etre plus proche de la structure reelle de la proteine, nous avons utilise comme ligands des heptapeptides analogues a la sequence de chelation du fer. La coordination efficace du motif cys-ser-cys au fer a ete prouvee avec une stoechiometrie de 1 fer/peptide et nos resultats ont permis d'etablir que la forme active des nhases possede probablement des soufres oxydes. Par la suite, nous avons etudie par une approche biochimique, le mode d'interaction de plusieurs inhibiteurs avec les nhases issues des souches r312 et ni1. Ces nhases peuvent etre inactivees stoechiometriquement par no conduisant a une forme stable feno de l'enzyme capable d'etre photoactivee ; nos resultats indiquent que no joue in vivo un role de regulation de l'activite nhase. Enfin, pour verifier l'eventuelle participation de la fonction sulfenate dans la catalyse, nous avons etudie l'influence de reactifs des acides sulfeniques sur l'activite des enzymes et avons caracterise trois nouveaux inhibiteurs de haute affinite (1<ki<50 m). La determination du mecanisme d'action de ces inhibiteurs devrait aboutir a la comprehension du mecanisme d'hydratation des nitriles par les nhases.