Compartimentation cellulaires et sub-cellulaires de la voie de biosynthèse des alcaloïdes indoliques monoterpéniques anticancéreux chez la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus)
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This thesis deals with the spatio-temporal study of the monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthetic pathway in Catharanthus roseus. For several decades, this tropical plant constitutes the only source for the production of vinblastine and vincristine, two valuable heterodimeric MIA used in anticancer treatments. The production yield of these molecules is very low and the current production depends for a large part on a hemisynthetic process that involves the coupling of two precursors monomeric MIA (vindoline and catharanthine) extracted from the leaves. So far the attempts to produce in vitro the active dimers, end products of the pathway, using C. Roseus cell suspensions have failed. Part of the explanation comes from the highly organized multicellular compartmentation of the MIA pathway, as recently demonstrated by studies from the lab. Indeed, in situ hybridisation and immunocytochemistry studies revealed the specific expression of nine genes of the MIA pathway among three populations of cell types in C. Roseus aerial organs. Four early-step genes are expressed in the internal phloem associated parenchyma, whereas three intermediate-steps are localized to the epidermis and two late-steps towards vindoline biosynthesis are localised to laticifers and idioblasts. The aim of this work is mostly to pursue this study in order to distinguish two successive steps within two different cell types allowing to identify the metabolite(s) subject to intercellular transportation. These results should provide important information to further be able to enhance the production of MIA in cell suspensions through metabolic engineering. The cell-specific expression of 13 new genes implied, or potentially implied, in the MIA pathway or involved in lateral branches has been determined using in situ hybridisation. The pathway was also studied at the sub-cellular compartmentation level with immunogold labelling in transmission electron microscopy.
Abstract FR:
Cette thèse concerne l'étude spatio-temporelle de la voie de biosynthèse des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) anticancéreux de Catharanthus roseus, aussi appelés Vinca-alcaloïdes. Cette plante tropicale constitue en effet depuis plusieurs dizaines d'années la source unique de production de vinblastine et vincristine, deux AIM hétérodimères utilisés dans le traitement de nombreux cancers. Les rendements de ces molécules dans les feuilles sont très faibles mais la production actuelle repose également sur un procédé d'hémisynthèse chimique à partir de deux AIM monomères précurseurs (vindoline et catharanthine). Les études visant à synthétiser ces biomolécules in vitro par des suspensions cellulaires de C. Roseus n'ont, à ce jour, pas permis la production des molécules d'intérêt, produits finaux de la voie de biosynthèse. Une des raisons de cet échec est le haut degré de compartimentation multicellulaire de cette voie de biosynthèse mis en évidence par des travaux antérieurs de l'équipe. En effet, des expériences d'hybridation in situ et d'immunocytochimie ont récemment permis de montrer l'expression spécifique de 9 gènes impliqués dans la voie des AIM au niveau de trois populations cellulaires différentes dans les organes aériens de C. Roseus. Quatre gènes des étapes précoces de la voie sont exprimés dans le parenchyme associé au phloème interne, trois étapes intermédiaires se déroulent dans l'épiderme, et les deux dernières étapes de la synthèse du précurseur monomère vindoline se situent dans les laticifères et les idioblastes. Le but de cette thèse concerne principalement la poursuite de la cartographie d'expression tissulaire de gènes impliqués dans la voie des AIM. Une cartographie plus complète devrait permettre à terme d'identifier deux étapes successives se déroulant dans deux tissus différents, identifiant ainsi les intermédiaires métaboliques candidats à un transport intercellulaire. Ces travaux constituent également le préalable indispensable à une amélioration de la production des AIM dans les suspensions cellulaires par ingénierie métabolique. Les travaux réalisés ont ainsi permis de localiser l'expression spécifique de 13 nouveaux gènes impliqués dans la voie de synthèse ou potentiellement impliqués dans cette voie, ou encore impliqués dans des voies latérales. Cette étude a également concerné le degré de complexité supplémentaire de cette voie que constitue la compartimentation sub-cellulaire (immunocytochimie en microscopie électronique en transmission).