Régulation de l'initiation de la réplication chez les vertèbrés : analyse du programme temporel d'activation des origines de réplication dans les extraits d'oeufs de xénope
Institution:
Paris 7Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
In Vertebrates, replication origins are activated according to a spatial and temporal program. In early Xenopus embryos, origins are located at apparently random sequences and are activated in clusters that fire at different times throughout S phase. The main object of the present work is to characterize the temporal regulation of replication in Xenopus egg extracts through analysis of origin activation on single DNA fibers and replication foci distribution in sperm nuclei. Using molecular combing of DNA, we compared the distributions of replication origins fired at the beginning of two following S phases. Absence of significative coincidence between origins shows that the temporal order of replication does not depend on genomic position. Furthermore, no epigenetic central regulates the moment of origin firing. However the detection of coincidence between replication foci labeled at the beginning of two following S phases suggests that the chromosomal organization may influence the replication timing. Using FISH, we showed that the replication of the ribosomic DNA is delayed compared to the replication of whole genomic DNA. An altered chromatin structure may be responsible for this delay. Mapping of origins revealed that initiation frequency is two fold lower in the G+C rich intergenic spacer than in the coding rDNA sequence. At the rDNA, local parameters such as nucleotide composition may influence the localization of replication origins.
Abstract FR:
Chez les vertébrés, l'activation des origines de réplication est soumise à une régulation spatiale et temporelle. Dans les embryons précoces de xénope, les origines sont positionnées sans aucune spécificité de séquence et sont activées en clusters à différents moments de la phase S. L'objectif principal de ce travail a consisté à caractériser cette régulation temporelle en analysant d'une part, l'activation des origines au sein de fibres individuelles d'ADN, et d'autre part, la distribution des foyers de réplication au sein de noyaux de spermatozoïde incubés dans des extraits d'œufs de xénope. Grâce à la technique de peignage moléculaire, nous avons comparé la distribution des origines de réplication au début de deux phases S consécutives. L'absence de coïncidence « temporelle » entre les origines démontre que le moment d'activation des origines ne dépend pas de la position génomique et qu'il n'existe pas de régulation épigénétique du moment de réplication à l'échelle des origines. Cependant l'observation d'une coïncidence entre les foyers utilisés au début de deux cycles consécutifs suggère qu'une organisation chromosomique pourrait influencer le moment de réplication. L'analyse de la réplication de l'ADN ribosomique par FISH a fourni un exemple de domaine chromosomique répliqué plus tardivement que l'ADN génomique global. Une structure chromatinienne particulière pourrait expliquer ce retard. Par ailleurs, la fréquence d'initiation à ce locus est deux fois plus faible dans l'espaceur intergénique très riche en G+C que dans la région codante. Au sein de ce locus, il pourrait donc exister des facteurs locaux influençant le positionnement des origines de réplication.