Caractérisation de l'endonucléase de homing I-SpomI et son application dans l'étude de la stabilité des génomes des eucaryotes
Institution:
Paris 7Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The present work deals with a new homing endonuclease, l-Spoml, of the fission yeast S. Pombe. L-Spoml consists of the 304 C-terminal amino acids of the ORF spanning cox1E1 and of cox1I1b (the entire ORF comprises 520 codons). L-Spoml belongs to the dodecapeptide family of homing endonucléases due to the presence of two LAGLIDADG motifs. In addition, the truncated ORF encodes all secondary structure elements that are typical for ail LAGLIDADG proteins characterized to date. L-Spoml cleaves the continuous S. Pombe coxl gene around the intron insertion site of its host intron. The shortened version of the ORF was expressed in E. Coli; produced l-Spoml was purified by affinity chromatography. The obtained protein was demonstrated to have specific endonucleolytic activity in vitro. Optimal conditions within the tested parameters for the I-Spoml cleavage activity were: 5 to 7. 5mM Mg2+, 60 to 80mM Na+, 42°C and pH 9. 6. L-Spoml inserts a DSB around the intron insertion site and generates 4bp 3' overhangs. The l-Spoml recognition site stretches over 20nt; 16nt of these are essentiel for substrate recognition. In a second part of this work, we tried to apply l-Spoml to generale DSBs in chromosomal DMA of S. Cerevisiae and S. Pombe. We applied as well the LAGLIDADG homing endonuclease l-Scel to reach this goal. After insertion of a marker gene surrounded by two l-Scel recognition sites we were able to induce site specific DSBs in the fission yeast nuclear genome. The marker gene was found to be lost in 70% of the cases. Without a repair template, DSBs were successfully repaired by NHEJ. If HR with an extrachromosomal template is possible, it seems to be ca. 10x more frequent.
Abstract FR:
Ce travail traite une nouvelle endonucléase de homing, baptisée l-Spoml, de la levure S. Pombe. L-Spoml consiste en 304 acides aminés de la phase ouverte de lecture comprenant cox1E1 et cox1I1b. L-Spoml fait partie de la famille dodecapeptide des endonucléases de homing à cause de la présence de deux motifs LAGLIDADG ainsi que tous les éléments nécessaires caractéristiques de toutes les protéines LAGLIDADG connues à ce jour. L-Spoml coupe dans le gène coxl de S. Pombe si son intron hôte n'est pas présent dans la séquence. La version courte de la phase ouverte de lecture (codant l-Spoml) a été exprimée dans E. Colï, la protéine a été purifiée en utilisant une chromatographie d'affinité. La protéine purifiée possède une activité endonucléolytique spécifique in vitro. Les conditions optimales de clivage ont été définies de façon suivante: 5 à 7. 5mM de Mg2+, 60 à 80mM Na+, 42°C et pH 9. 6. Nous avons déterminé le site de coupure autour du site d'insertion de l'intron et montré que le clivage génère des bouts 3' sortant de 4pb. Le site de reconnaissance de l-Spoml a été défini: il comprend 20nt dont 16nt sont essentiels à la reconnaissance du substrat. Puis, nous avons cherché de générer des cassures double-brin dans les génomes de S. Cerevisiae et S. Pombe avec l-Spoml. Nous avons utilisé l-Scel pour arriver à ce but. Suite à l'insertion d'un marqueur bordé par deux sites de cet enzyme nous avons pu induire des CDBs dans le génome de S. Pombe. Le marqueur a été perdu dans 70% des cas après expression de l-Scel. Les CDBs ont été réparées par NHEJ en absence d'une matrice de réparation extrachromosomique mais majoritairement par recombinaison homologue en présence d'une telle matrice.