Evaluation of blood-brain barrier in vitro models and application for studying barrier disruption induced by gram-positive bacteria
Institution:
ArtoisDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillary endothelial cells (BCECs), separates the cerebral compartment from the systemic circulation, playing a fundamental role in maintaining the homeostasis of the central nervous system (CNS). The important role that BBB plays both under physiological and pathological conditions lead scientist to look for in vitro models to study the cellular and molecular mechanisms responsible for the permeability variations of this barrier. In regulatory toxicology and in the context of the current European Union political scenario, the development and validation of in vitro models is of outmost importance. The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) organised in 2003 a workshop on “BBB in vitro methods and their application in toxicology” to discuss the in vitro models available and their application in integrated testing strategies. Taking into consideration the outcomes of this workshop and according to the 3Rs concept (reduction, refinement and replacement), we replaced in a well-established BBB in vitro model the primary glial cells (GCs) necessary for the differentiation of BCECs with the C6 glial cell line, to avoid the use of animals. For the first time, we compared directly the structural and functional differentiation of BCECs induced by C6 cells towards GCs. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) measurements showed that in the presence of C6 cells the values were always lower than in the presence of GCs. Permeability of the BCECs to both radioactive sucrose and FITC-inulin was 2. 5-fold higher when cells were co-cultured with C6 than with GCs. Immunocytochemistry studies showed less developed tight junction pattern in the presence of C6. P-gp expression and activity were lower in BCECs co-cultured with C6 than with GCs. The levels of VEGF in the culture medium were 40-fold higher in the presence of C6, suggesting that VEGF was one of the factors responsible for impairing the endothelial barrier co-cultured with C6 cells. Therefore, C6 cell line failed to replace primary GCs in a reliable BBB in vitro model. Furthermore, we used the BBB model consisting of BBCECs co-cultured with primary GCs to investigate the effects of the Gram-positive bacterial cell wall components lipoteichoic acid (LTA) and muramyl dipeptide (MDP) on the structure and function of BBB in vitro. The activation of GCs with LTA disrupted BBB integrity and LTA effect was potentiated by MDP. Immunocytochemistry analysis for tight junction associated proteins showed a delocalisation of AHNAK, revealing that LTA altered the tight junction pattern. LTA-activated GCs produced nitric oxide (NO) and the pro-inflammatory cytokines TNF-a and IL-1b, which contributed to LTA-induced BBB disruption, since the direct treatment of the endothelial monolayer with TNF-a, IL-1b or a NO donor increased BBB permeability. In addition, the pre-treatment of LTA-activated GCs with antibodies against these two cytokines blocked LTA effect and the presence of 1400W, inhibitor of inducible NO synthase (iNOS), partially reversed LTA-induced decreased TEER. This study showed for the first time that LTA impaired the BBB in vitro through glia activation and suggested that free-radical scavengers and inhibitors of iNOS and of pro-inflammatory cytokines could be major targets for the adjunctive therapy of CNS pathologies induced by Gram-positive bacteria.
Abstract FR:
La barrière hémato-encéphalique (BHE) située au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) sépare le cerveau de la circulation systémique, jouant un rôle fondamental dans l'homéostasie du système nerveux central (SNC). Le rôle important de la BHE tant en conditions physiologiques que pathologiques a conduit les chercheurs à mettre au point des modèles de BHE in vitro afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des variations de la perméabilité de cette barrière. La réglementation en toxicologie et la politique actuelle de l’Union Européenne, encourage fortement le développement et la validation de modèles in vitro. Le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives (ECVAM) a organisé en 2003 une réunion de travail sur les "méthodes in vitro de BHE et leur application en toxicologie" pour évaluer les modèles in vitro disponibles et discuter de leur application dans des stratégies de tests. Suite à cette réunion et en suivant le concept "réduire, améliorer, remplacer" qui tient lieu de ligne de conduite dans la mise au point des méthodes alternatives à l’expérimentation animale, nous avons remplacé, dans le modèle habituellement utilisé au laboratoire, les cultures primaires de cellules gliales (GCs) nécessaires à la différenciation des cellules endothéliales cérébrales, par la lignée C6. Pour la première fois, l’induction des caractéristiques structurales et fonctionnelles de la BHE a donc été comparée dans les BCECs placées en présence de GCs ou de C6. Les mesures de la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) montrent qu’en présence de C6 les valeurs sont toujours inférieures à celles obtenues en présence de GCs. De plus la perméabilité endothéliale au saccharose et à l’inuline est 2,5 fois plus élevée en présence de C6. Les études réalisées en immunofluorescence mettent en évidence une différenciation moins bonne des jonctions serrées en présence de C6. L’expression et l’activité de la P-gp sont fortement diminuées. La quantité de VEGF dosé dans les milieux de culture est 40 fois plus importante en présence de C6, ce qui pourrait expliquer la perméabilité élevée des BCECs co-cultivées avec les C6. Les résultats montrent donc que l’utilisation des C6 à la place des GCs ne permet pas d’obtenir un modèle fiable de BHE in vitro. Le modèle initial consistant en une co-culture de BCECs et de GCs a donc finalement été utilisé pour étudier l'effet de l'acide lipoteichoïque (LTA) et du muramyl dipeptide (MDP), composants de la paroi des bactéries Gram-positives, sur la structure et les fonctions de la BHE in vitro. L’activation des GCs par le LTA perturbe l'intégrité de la BHE. Cet effet est renforcé par le MDP. L’étude en immunofluorescence des protéines associées aux jonctions serrées montre une délocalisation d’AHNAK indiquant un effet du LTA sur les jonctions serrées. L’activation des GCs par le LTA a conduit à une sécrétion d’oxyde nitrique (NO) ainsi que de TNF-a et d’IL-1β, cytokines pro-inflammatoires. Ces composés contribueraient à la rupture de la BHE induite par le LTA. En effet le traitement direct des BCECs par le TNF-a ou l’IL-1β ou un donneur de NO augmente la perméabilité de la BHE. De plus, le prétraitement par des anticorps dirigés contre les deux cytokines, des GCs activées par le LTA, bloque l'effet du LTA. La présence d’un inhibiteur de la NO synthase inductible (le 1400W) limite l’augmentation de la perméabilité induite par le LTA. Cette étude prouve pour la première fois que l’activation des GCs par le LTA altère la BHE in vitro et montre que la NO synthase inductible et des cytokines pro-inflammatoires pourraient être les cibles thérapeutiques dans les pathologies du SNC induites par les bactéries Gram-positives.