Transfert direct de gènes chez le tabac et la tomate par manipulation de protoplastes
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Tobacco mesophyll protoplasts were transfected with a plasmid, pLGVneo, carrying a kanamycin resistance gene expressed in plant tissues. Transfections were performed by fusion of protoplasts with liposomes in which the plasmid had been encapsulated. A hundred independent clones, selected for their resistance to kanamycin, were regenerated and characterized. When tested for their level of resistance at the protoplast level, clones expressed a wide range of resistance to aminoglycosides. The level of resistance to paromomycin was not correlated to the number of copies of the inserted plasmid sequences. Resistance to kanamycin segregates in a Mendelian manner, as a monogenic, dominant nuclear marker for 50% of the tested plants. Various new phenotypes were observed among the regenerated plants or in their progeny, but no evidence for the mutagenic effect of inserted sequences was found. The new phenotypes observed are therefore due to somaclonal variation. The kanamycin resistance marker was found to be linked to another genetic marker, Vair, in one of the transformants, Ka110. Several transformants did not stahly transmit the kanamycin resistance marker. Clone Ka120 transmitted kanamycin resistance nonnally when used as a female parent, but transmitted the resistance at a very low frequency (2% instead of 50 %) when used as a pollen donor.
Abstract FR:
Le transfert direct de gènes a été optimisé en utilisant des protoplastes de mésophylle de tabac. Une tension optimale de trois volts par cm a été déterminée. Le chlorure de potassium s'est avéré être le meilleur électrolyte. Quatre-vingt-trois plantes de tabac transformées, résistantes à la kanamycine, ont été analysées. La résistance à la kanamycine se transmettait comme un marqueur mendélien, pour les plantes de cinquante-trois clones analysés. Les plantes de certains clones ne transmettaient pas le marqueur de résistance à leur descendance, et d'autres le transmettaient de façon non mendélienne. Ces plantes ont été analysées plus précisément. Des modifications phénotypiques ont été observées chez certaines plantes transformées et dans leur descendance, mais aucune corrélation avec la résistance à la kanamycine n'a été mise en évidence. Les conditions de culture des plantes de tomate, et de préparation des protoplastes ont été optimisées pour obtenir une grande quantité de protoplastes viables. Le nitrate d'ammonium, le chlorure de calcium, le myo-inisitol, et le saccarose se sont montrés indispensables pour la culture de protoplastes de tomate. Des protoplastes de Lycopersicon esculentwn et de Lycopersicon peruvianwn ont été électroporés en présence de plasmides conférant la résistance soit à la kanamycine, soit au chlorsulfuron. Des colonies résistantes ont été sélectionnées dans les deux cas. La présence du gène étranger a été vérifiée par hybridation moléculaire, dans deux plantes de L. Peruvianum résistantes à la kanamycine. Les plantes du clone Lp1Kr transmettent la résistance à la kanamycine de façon mendélienne.