Abstract FR:

La nadph oxydase est un complexe enzymatique multiproteique dont l'activite resulte de l'assemblage au niveau d'un composant membranaire redox, le cytochrome b 5 5 8, et de facteurs proteiques solubles, p67phox, p47phox, p40phox et rac1/2. Elle catalyse le transfert d'electrons depuis le substrat nadph jusqu'a l'oxygene, conduisant a la production d'ions superoxyde o2. Les mecanismes de l'assemblage du complexe oxydase et les modalites du transport d'electrons qui en resultent ne sont pas encore totalement elucides. Notre travail a consiste a etudier un modele de granulomatose septique caracterisee par l'absence du facteur cytosolique p67phox. Nous nous sommes attaches (1) a restaurer une activite oxydase dans les cellules modele utilisees (les lymphocytes b-ebv) par complementation avec la proteine manquante in vitro puis ex vivo et (2) a analyser les modalites de l'interaction des facteurs cytosoliques p67phox et p40phox. Les resultats montrent que dans les mecanismes d'assemblage des constituants de l'oxydase, le facteur cytosolique p67phox est limitant : dans la granulomatose septique cgdp67() le turnover de l'oxydase est de l'ordre de 10 a 20 s 1, apres complementation in vitro par le facteur p67phox recombinant il atteint une valeur (155 a 179 s 1) proche de celle des temoins (sujets sains). Mais l'activite oxydase restauree est complete seulement si les constituants de l'oxydase, incubes dans un milieu de reconstitution (systeme acellulaire heterologue), sont isoles de leur environnement tissulaire (membrane et cytosol) ce qui suggere la presence d'un facteur intervenant dans une regulation negative des mecanismes d'assemblage. Enfin le transfert des facteurs cytosoliques a la membrane implique la dissociation du complexe p67phox/p40phox dans le maintien de l'etat latent du complexe. La transfection ex vivo des lb-ebv mutants, a l'aide du vecteur pcep4, ne restaure pas d'activite oxydase alors que celle-ci est surexprimee dans les lb-ebv sains. Au contraire par transfection vectorialisee de exos-p67phox nous avons ete capables de complementer l'activite nadph oxydase de lb-ebv de cgdp67() d'environ 40% par rapport a l'activite temoin. Ces resultats demontrent que les mecanismes d'assemblage du complexe oxydase different in vivo de ce que l'on peut observer apres reconstitution in vitro.