Abstract FR:

La méthionyl-tARN synthétase (metRS) d'E. Coli catalyse le transfert de la méthionine sur les tARNmet(s)·Sa structure tridimensionnelle est connue à 1. 8Å de résolution et les paramètres cinétiques des deux étapes de la réaction (activation de la méthionine et transfert sur l'extrémité 3'-acceptrice du tARNmet) ont été déterminés. L'étude présentée dans cette thèse est destinée à élucider les relations structure-activités de cette enzyme en utilisant les techniques de la mutagénèse dirigée. Dans un premier temps des vecteurs (pNAV) permettant d'exprimer des formes modifiées de la metRS ont été construits. L'organisation en domaines fonctionnels a ensuite été analysée en étudiant les propriétés catalytiques de variants protéiques raccourcis dans la partie C-terminale. L'implication de la région 530-547 a ainsi été démontrée. Dans le but de préciser le rôle fonctionnel de cette région, une étude par mutagénèse dirigée à l'aide d'oligonucléotides a été effectuée. Ces résultats conduisent à la définition d'une synthétase minimale fonctionnelle, 547 acides aminés sont nécessaires et suffisants pour catalyser le transfert de la méthionine sur le tARNmet. Le gène codant pour cette protéine formée des 547 premiers résidus a été utilisé comme matrice pour les expériences ultérieures de mutagénèse dirigée. En accord avec les études effectuées par marquage chimique, la substitution de la lysine 335 se traduit par une inactivation complète des deux activités catalysées par la méthionyl-tARN synthétase, indiquant que cette lysine pourrait jouer un rôle direct dans la catalyse. La recherche des points de contact du tARN a permis de localiser deux régions de la protéine impliquées dans l'interaction avec la boucle de l'anticodon (trp461) d'une part et l'extrémité 3'-acceptrice du tARNmet d'autre part (530-537). En particulier, la région 530-537 doit assurer le guidage du bras accepteur du tARN vers le centre catalytique de l'enzyme (lysine 335). L'intercalation du tryptophane 461 entre deux bases de la boucle de l'anticodon qui contribue de manière très importante à la stabilisation du complexe spécifique démontre bien l'importance de la reconnaissance de la boucle anticodon du tARN.