Étude du caractère électrogène et de la sensibilité au voltage du transport de D-glucose couplé au sodium à travers la membrane de vésicules de bordures en brosse intestinales de cobaye et de porc
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Electrogenicity and voltage dependance of sodium coupled D-glucose transport across brush border membrane vesicles from guinea pig and pig intestines. We have studied the electrogenicity and voltage dependance of intestinal Na+/D glucose cotransport. The incorporation of D-glucose into brush border membrane vesicles was measured by a rapid filtration technique in the presence of an initially inward Na+ gradient. The membrane potential was held at the equilibrium potential for K+ by addition of valinomycin. We show that the approximation EM=EK is valld under our experimental conditions, but that valinomycin has no effect in the presence of FCCP or lanthanum. The rate of entry of D-glucose (0,1 mM) was not increased above that due to diffusion by 1 M K+, Rb+, Cs+, or choline+. Only Na+ and Li+ (1M) induced a saturable D-glucose transport that was activated at zero or hyperpolarized membrane potentials, and that resulted in a transient accumulation (overshoot) of intravesicular glucose, demonstrating an energy transduction between the electrochemical gradient for Na+ and glucose. Transport kinetics were measured at a variety of membrane potentials and as a function of the Na+ or D-glucose concentration gradient. Nonlinear regression analysis using the michales-menton equation modified to allow for nonsaturable diffusion showed that : 1) Na+ is a nonobligatory activator of transport. 2) Na allosterically increases bath V and K. 3) Only the maximal velocities vs and va are voltage dependent. 4) an average Hill coefficient of 1. 6 for the kinetics of activation by Na+ suggests a stoichiometry greater than 1. 5) a trans inhibition by Na+ was present at concentrations greater than 10 mM. 6) only when the allosteric activation by Na is maximal do equivalent increases in the electrochemical gradient induced either chemically or electrically cause a comparable activation of transport. 7) the vesicles have an inherent membrane potential of between +5 and +20 mV. A kinetic madel of transport postulating a random arder of cosubstrate binding and translocation as the rate-limiting step was developed and applied ta experimental data by nonlinear regression. The anionic permeability sequence of brush borders could be estimated from the activation of D-glucose transport. The permeability of Cl- is particularly low (close ta that of gluconate), white SCN, N03, and N3 appear very permeant. Studies using the voltage sensitive fluorescent dye diS-C3-(5) show that the presence of actively transported sugar induces a membrane depolarization, suggesting the development of an inward Na+ current dependent on 0-glucose.
Abstract FR:
Nous avons étudié le caractère électrogène et la sensibilité au voltage du symport Na+/D glucose intestinal. L'incorporation de D-glucose dans des vésicules de Bordures en Brosse est mesurée par une technique de filtration rapide, en présence d'un gradient initial entrant de sodium. Le potentiel de membrane. Est imposé par la valinomycine à la valeur du potentiel d'équilibre du potassium. Nous montrons que l'approximation Em=EK est vérifiée dans nos conditions expérimentales, mais que la valinomycine n'a aucun effet en présence de FCCP ou de lanthane. Aucune prise de 0-glucose (0,1mM) supérieure à la diffusion n'est mesurée avec une concentration molaire de K+, Rb+,Cs+, choline+. Seul le sodium et le lithium (1M) occasionne un transport saturable de D-glucose, qui est activé par un potentiel de membrane nul ou négatif et qui se traduit par une accumulation transitoire du sucre (overshoot), attestant la transduction énergétique qui s'opère entre les gradients électrochimiques de sodium et de glucose. Un ensemble de cinétiques de transport mesuré pour différentes valeurs du potentiel de membrane et en fonction des concentrations cis et trans de sodium ou de D-glucose est présenté. Leur analyse par régressions non linéaires à une équation comprenant un terme michaélien et une diffusion non saturable montre que -(i) le sodium n'est pas un activateur obligatoire chez le cobaye ; (ii) son effet allostérique est mixte (V et K); (iii) les vitesses maximales Vs et Va sont les seuls constantes affectées par le potentiel de membrane; (iv) un coefficient de Hill moyen de 1,6 pour les cinétiques d'activation par le sodium suggéra une stoechiométrie supérieure à 1; (v) une trans inhibition du sodium est mesurée pour une concentration supérieure à 10 mM, avec un coefficient de hill de 2; (vi) l'activation allostérique par sodium doit être maximale pour qu'une énergisation similaire d'origine chimique ou électrique se traduise par une activation du transport comparable; (vii) le potentiel de membrane spontané dès vésicules est positif, se situant dans l'intervalle +5 à +20 mV, dont l'origine doit provenir d'une PNa(D-glucose)•Un modèle cinétique de transport postulant une fixation non ordonnée des co-substrats, et les étapes de translocation limitantes est développé, et appliqué aux données expérimentales par régression non linéaire. Une échelle des perméabilités anioniques des Bordures en Brosse a pû être proposée en fonction de l'activation du transport de D-glucose. Elle souligne la faible perméabilité du chlore (proche du gluconate) alors que le SCN, le N03 et le N3 apparaissent très perméant pour ces membranes. Les études avec la sonde fluorescente de potentiel diS-C3-(5) montre que la présence de sucres activement transportés induit une dépolarisation membranaire impliquant le développement d'un courant entrant de sodium dépendant du D-glucose.