Recherches sur l'origine de l'acide α-cétoglutarique associé à l'assimilation de l'azote chez les végétaux supérieurs : étude de l'isocitrate déshydrogénase à NADP
Institution:
Paris 11Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
2-oxoglutarate provides the carbon skeleton implicated in the biosynthesis of glutamate. In spite of its fundamental function, the subcellular site of its production has never been thoroughly addressed. This thesis is focused on the NADP-isocitrate dehydrogenase (NADP-IDH) (E. C. 1. 1. 1. 42), one of the enzymes catalyzing the oxidation of isocitrate to 2-oxoglutarate in higher plants. The enzyme has been found to exist as multiple forms, which are localized both in the cytosol and chloroplasts. The cytosolic enzyme of Pisum sativum cv Finale has been purified to homogeneity from roots and green leaves; it constitutes an organ specific enzyme. The immunological properties of the enzyme extracted from various Cormophytes have been compared and it is concluded that the cytosolic NADP-IDH is a highly conserved protein. An NADP-IDH isoenzyme specific to chloroplasts has been identified in pea. The purified enzyme exhibits physicochemical and kinetic properties different from those of its cytosolic counterpart. Extended to other higher plants this result shows that in the course of evolution the importance of the chloroplastic enzyme decreases versus the cytosolic enzyme. Using the antibodies raised against the cytosolic enzyme to screen a cDNA library from Sorghum leaf poly (A +) mRNA in the expression vector λgtll, we have isolated a cDNA clone for this enzyme. The size of the mRNA was estimated to be 1. 7 kb. These results suggest that the cytosolic NADP-IDH could take an important role in providing the 2-oxoglutarate used for glutamate biosynthesis in chloroplasts.
Abstract FR:
Malgré le rôle fondamental de l'acide α-cétoglutarique dans la biosynthèse des acides aminés, le système enzymatique et le territoire cellulaire responsables de sa synthèse en vue de la production de l'acide glutamique et des composés qui en dérivent, n'ont jamais été identifiés. Pour contribuer à combler ces lacunes, cette thèse se focalise sur l'isocitrate déshydrogénase à NADP (EC 1. 1. 1. 42), une des enzymes qui catalyse l'oxydation de l'isiocitrate en α-cétoglutarate chez les végétaux supérieurs. Les formes multiples de l'enzyme ont été identifiées; elles sont localisées dans le cytosol et les chloroplastes. L'enzyme cytosolique de Pisum sativum cv finale a été purifiée à homogénéité à partir des racines et des feuilles. Il est démontré que l'IDH à NADP cytosolique est une enzyme organe-spécifique. Par approches immunochimiques, il est fortement suggéré que les isoenzymes cytosoliques des cormophytes ont été conservées au cours de l'évolution. Une isoenzyme spécifique des chloroplastes a été mise en évidence chez le Pois; elle possède des propriétés différentes de l'isoenzyme cytosolique. Il apparaît qu'au cours de l'évolution l'importance relative de l'isoenzyme chloroplastique décroît au profit de la forme cytosolique. Le criblage d'une banque d'ADN complémentaire de Sorgho dans le vecteur d'expression λgtl à l'aide d'anticorps polyclonaux a permis d'isoler une ADNc pour cette enzyme. Grâce à cette sonde, la taille de l'ARNm de l'IDH à NADP a été estimée à 1. 7 kb par la technique de Northern. Les résultats obtenus dans ce travail suggèrent que l'isiocitrate déshydrogénase à NADP pourrait jouer un rôle essentiel dans la production d'α-cétoglutarate lequel pourrait éventuellement être utilisé dans les chloroplastes pour la biosynthèse du glutamate.