Rôle et régulation de l'autophagie dans les tumeurs exprimant l'oncogène ALK
Institution:
Toulouse 3Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Anaplastic Lymphoma Kinase positive Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALK+ ALCL) are an aggressive pediatric disease. They are characterized by chromosomal translocations involving the ALK gene with various translocation partner genes. NPM-ALK is the most prominent fusion protein observed. It results from the t(2;5) (p23;q35) chromosomal translocation and leads to the constitutive activation of the tyrosine kinase domain, which is driving lymphomagenesis through the activation of multiple survival/proliferation pathways. Therapeutic options comprise chemotherapy, which is efficient in about 70% of the patients, and targeted therapies, such as crizotinib (an ALK tyrosine kinase inhibitor) used in refractory/relapsed cases. Efforts converged also towards the development of combined therapies to improve treatment. In this context, we studied whether autophagy could be modulated to improve crizotinib therapy. Autophagy is a vesicular recycling pathway, known to be associated either with cell survival or cell death depending on cancers and therapies. The Unc-51-like kinase-1 (ULK1) protein plays a critical role in the autophagy initiation stage and is regulated mainly through AMPK- or mTOR- mediated serine/threonine phosphorylations on key residues. In NPM-ALK+ ALCL cell lines, previous work of my host team had demonstrated that autophagy was induced upon NPM-ALK inactivation, and was endowed with cytoprotective functions. During my PhD, I first reviewed the cytoprotective, or inversely, cytotoxic roles of autophagy upon therapy in various other ALK-dependent cancers. Then, my main thesis project was to identify microRNAs (miRNAs) and their potential targets that could be therapeutically modulated, in addition to crizotinib treatment, to drive autophagy towards cytotoxic functions and the outcome of tumor cells death. Indeed, deregulation of miRNA expression levels have been extensively described in cancers, including in NPM-ALK+ ALCL, and have also been shown to modulate the autophagy responses upon therapies. My work led to the demonstration that miRNA-7-5p, known primarily to harbor tumor suppressive functions in diverse cancer types, and RAF1, one of its targets, play essential roles in NPM-ALK+ ALCL, by controlling autophagy flux and tumor cell fate. RAF1 is a serine/threonine kinase, best known to connect RAS to the MEK/ERK pathway. However, the mechanism by which RAF1 inhibition, specifically, could induce autophagy had not been described so far. Our work points out for the first time the possible phosphorylation of ULK1 on its serine757 inhibitory residue by RAF1 (and not MEK or ERK), which opens up a new therapeutic avenue to modulate the autophagy flux in ALK+ ALCL. In a second part of my project, and to better understand the potential link between RAF1 and ULK1, I gave several attempts to purify autophagosomes from NPM-ALK+ ALCL cells. While our results suggest that NPM-ALK could be detected in an autophagosome-enriched fraction, further investigations will determine whether RAF1 and ULK1 could co-localized at autophagosomal membranes. Altogether, our results strengthens that autophagy lays at a center place for NPM-ALK+ ALCL tumor cells fate upon crizotinib treatment, and stressed that NPM-ALK and RAF1 combined inactivation, by increasing autophagy flux, might be beneficial for ALK+ ALCL patients.
Abstract FR:
Le lymphome anaplasique à grandes cellules ALK positif (LAGC ALK+) est un cancer pédiatrique très agressif. Il se caractérise par des translocations chromosomiques impliquant toujours le gène ALK et différents autres gènes, partenaires de translocation. NPM-ALK (Nucleophosmine- Anaplastic Lymphoma Kinase) est la protéine de fusion à activité tyrosine kinase la plus fréquemment observée. Elle résulte de la translocation chromosomique t(2;5)(p23 ;q35) et l'activation constitutive de son domaine catalytique permet le développement du lymphome, par l'activation de nombreuses voies de signalisation de survie et de prolifération. Les thérapies actuelles sont la chimiothérapie, qui est efficace dans 70% des cas, ou une thérapie ciblant l'oncogène ALK (notamment l'inhibiteur tyrosine kinase Crizotinib), qui est utilisée chez les patients réfractaires ou en rechute. Les efforts de la communauté scientifique convergent également au développement de thérapies combinées, pour améliorer le traitement de ces lymphomes. Dans ce contexte, nous étudions si l'autophagie peut être modulée pour améliorer la réponse au crizotinib. L'autophagie est un processus vésiculaire d'autodigestion, connu pour être associé soit à la survie, soit à la mort cellulaire, selon le type de cancer et de thérapie. La protéine ULK1 (Unc-51-like kinase-1) joue un rôle majeur dans l'initiation de ce processus et est régulée principalement par des phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine, qui sont assurées par les kinases mTOR ou AMPK. Dans les lignées de LAGC ALK+, des travaux antérieurs de l'équipe ont montré qu'une autophagie cytoprotectrice était induite lors de l'inactivation de l'oncogène NPM-ALK. Durant ma thèse, j'ai tout d'abord répertorié le rôle cytoprotecteur ou, à l'inverse, cytotoxique de l'autophagie dans différents cancers dépendants de l'oncogène ALK, et soumis à différentes thérapies. Mon projet de thèse principal a ensuite été d'identifier des microARNs ainsi que leurs cibles potentielles, dont la manipulation thérapeutique pouvait, en association avec le crizotinib, conduire à une autophagie associée à la mort des cellules tumorales. En effet, des dérégulations du niveau d'expression des microARNs ont été abondamment décrites dans différents cancers, incluant les LAGC ALK+, et leurs capacités à moduler la réponse autophagique sous thérapie a également été démontrée. Mon travail de thèse a permis de démontrer que le microARN-7-5p, connu pour ses propriétés anti-tumorales, et RAF1, une de ses cibles, jouaient un rôle crucial dans les LAGC ALK+, en contrôlant le flux autophagique et le devenir cellulaire. RAF1 est une sérine /thréonine kinase, essentiellement connue pour connecter RAS à la voie de prolifération MEK/ERK. Cependant, le mécanisme par lequel l'inhibition spécifique de RAF1 peut influer sur l'autophagie n'a encore jamais été décrit. Nos travaux montrent pour la première fois la capacité pour RAF1 (et non MEK ou ERK) de phosphoryler ULK1 sur le résidu inhibiteur sérine 757, ce qui offre une nouvelle voie thérapeutique pour moduler le flux autophagique dans les LAGC ALK+. Dans une seconde partie de ma thèse, et afin de mieux comprendre ce lien potentiel entre RAF1 et ULK1, nous nous sommes attachés, selon deux protocoles différents, à purifier les autophagosomes à partir d'une lignée cellulaire de LAGC ALK+. Nos résultats suggèrent la présence de NPM-ALK dans nos fractions enrichies en autophagosomes, et ces travaux seront poursuivis pour détecter RAF1 et ULK1 dans ces mêmes fractions. Ainsi, nos résultats démontrent l'importance de l'autophagie dans la réponse des LAGC ALK+ au crizotinib et mettent au jour que la combinaison thérapeutique consistant à inhiber NPM-ALK et RAF1, en potentialisant le flux autophagique, pourrait être bénéfique pour les patients atteints de ce lymphome.