Abstract FR:

Le diabète insulino-dépendant est une maladie auto-immune détruisant les cellules sécrétrices d'insuline et aboutissant donc à une carence en cette hormone qui entraîne des anomalies du métabolisme des hydrates de carbone, des protéines et des graisses. Le diabète insulino-dépendant est généralement traité par administration d'insuline, traitement contraignant qui ne permet pas de renforcer la sécrétion endogène d'insuline, finement contrôlée en fonction des besoins. Dans une perspective de thérapie génique symptomatique du diabète insulino-dépendant, nous nous sommes fixés pour objectif de substituer aux injections d'insuline, la délivrance de l'hormone par des cellules génétiquement modifiées imitant la fonction des cellules bêta du pancréas. Deux exigences sont essentielles pour ce type de thérapie : la production d'insuline en réponse à la glycémie, et la maturation de la proinsuline produite en insuline active. Possédant de nombreuses caractéristiques communes à la cellule bêta pancréatique, l'hépatocyte a été choisi pour produire de l'insuline. Dans une première étape, nous avons pu montrer que le gène CAT sous le contrôle du promoteur du gène de la pyruvate kinase (PK-L) s'exprime en réponse au glucose dans les cellules hépatiques génétiquement modifiées par un rétrovirus portant ce transgène. Dans une deuxième étape, pour produire de l'insuline dans le foie, nous avons muté les séquences d'ADNc des jonctions des peptides B/C et C/A de l'insuline humaine, permettant ainsi sa reconnaissance par la protéine convertase SPC1 fortement exprimée dans les hépatocytes. Lorsque l' ADNc de l'insuline mutée est placé sous le contrôle du promoteur CMV, la proinsuline est synthétisée puis transformée en hormone mûre qui est sécrétée par des hépatocytes après transfection transitoire et stable. L'insuline mutée produite est physiologiquement active. A la suite de ces expériences, nous avons construit un rétrovirus portant l'ADNc de l'insuline mutée sous le contrôle du promoteur PK-L. Les cellules hépatiques infectées par le rétrovirus ne produisent pas de concentration détectable d'insuline, probablement parce que le promoteur PK-L est très faible. En effet, lorsque nous analysons des souris transgéniques portant plus d'une centaine de copies du transgène PK-L/insuline, les hépatocytes en culture primaire produisent de l'insuline sous le contrôle du glucose, mais en concentration faible. Pour augmenter l'activité du promoteur PK-L, nous avons utilisé un enhancer hépatique dérivé du premier intron du gène de l'aldolase B (AL). Cet enhancer permet d'augmenter considérablement l'activité du promoteur PK-L qui conserve sa réponse au glucose. Dans le contexte des séquences rétrovirales, l'activité du promoteur PK-L diminue mais reste stimulée par l'adjonction de l'enhancer AL. Pour améliorer l'expression de ce transgène insuline, nous avons construit plusieurs rétrovirus portant l'ADNc de l'insuline mutée sous le contrôle du promoteur PK-L avec différents éléments régulateurs en position sens ou sens inverse par rapport au promoteur LTR viral. L'étude de l'expression du transgène dans les cellules hépatiques infectées par ces différents rétrovirus suggère que l'enhancer AL augmente l'expression du promoteur interne PK-L lorsqu'il est en position inverse par rapport au LTR. En revanche, placé dans la même orientation par rapport au promoteur LTR, l'enhancer ne semble pas efficace pour obtenir une expression élevée du transgène. Enfin, bien que le niveau d'expression de l'insuline nécessite une forte augmentation, nous avons montré que le promoteur PK-L peut être utilisé pour la production d'insuline mûre par les hépatocytes en réponse au glucose. Ces résultats constituent donc une base intéressante pour la mise au point future d'une possible thérapie génique symptomatique du diabète insulino-dépendant.