Abstract FR:

La nucleoside diphosphate kinase (ndpk) est un enzyme ubiquitaire, qui catalyse la formation des nucleoside triphosphates a partir des diphosphates et maintient l'equilibre de leurs concentrations aux depens de l'atp. La reaction de type ping-pong est tres efficace et passe par un intermediaire phospho-histidine. La ndpk est un tetramere chez certaines bacteries, un hexamere chez les eucaryotes. La sous-unite comporte un domaine a/b organise autour d'un feuillet-b a 4 brins antiparalleles. Outre son role dans la biosynthese des nucleotides, l'enzyme humain aurait une activite histidine kinase et lierait l'adn. De plus, ell serait impliquee dans la proliferation des metastases et dans l'activation de la transcription de certains genes. Dans cette these, nous presentons six structures cristallines de la ndpk de dictyostelium complexee avec des substrats, des analogues ou des inhibiteurs. Elles permettent de mieux comprendre le mecanisme de la catalyse et l'interaction avec des analogues de nucleotides anti-viraux, en visant a la conception de medicaments et a la mutagenese fondee sur la structure. La structure du complexe ndpk. Adp. Alf3 decrit la geometrie de l'etat de transition de la reaction de transfert de phosphate. Alf3 mime le phosphate-g de l'atp lors de son transfert sur l'histidine du site actif par un mecanisme d'attaque en ligne passant par un intermediaire bipyramid trigonal. Des complexes ndp. Aif3 similaires ont depuis ete decrits dans d'autres kinases. La structure du complexe ndpk. Adp. Bef3 illustre le mode fixation de l'atp. Ces deux structures definissent les interactions enzyme-substrat et mettent en evidence deux elements essentiels de la catalyse : l'ion mg++ et le oh en 3 du sucre sur le nucleotide. Nous avons analyse les cinetiques de phosphorylation et dephosphorylation des nucleotides par la ndpk aal'aide de la fluorescence intrinseque de la proteine. Les analogues antiviraux derives de l'azt et de la ddt sont de mauvais substrats de la ndpk en comparaison du substrat naturel tdp. La faible phosphorylation de l'azt s'explique par deux facteurs structuraux : l'absence de la liaison hydrogene entre le 3oh et l'oxygene pontant les phosphates b et g ; le deplacement de la chaine laterale du residu lys 16. La structure cristalline du complexe avec l'azt diphosphate donne une base structurale a la conception de nucleosides antiviraux qui soient de meilleurs substrats de la ndpk. Celles des complexes ndpk avec les deux antiviraux 3-fluoro-udp et 3-amino-adp permet de comprendre pourquoi ce sont aussi de mauvais substrats ; dans les deux cas, la modification en 3 du sucre change l'interaction avec la proteine. Le 3'-phospho-adenosine-5-phosphosulfate (paps) est un inhibiteur puissant de l'activite enzymatique de la ndpk. La structure cristalline du complexe revele qu'il se fixe sur le meme site que l'adp, mais d'une facon differente, qui donne des indications sur le mode de fixation de l'adn.