Dynamique intracellulaire des protéines nucléolaires
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Abstract EN:
The nucleolus is the site where synthesis and maturation of ribosomal RNAs occur. The tandemly repeated rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I associated to several transcription factors. Among them, the Upstream Binding Factor (UBF) is expressed from a unique gene by alternative splicing as two isoforms, UBF1 and UBF2. In order to visualize both variants, which are not discriminated by specific anti-UBF antibodies, we previously developed chimeric proteins between UBF1/UBF2 and GFP. Moreover, it is well-known that inhibition of RNA polymerase I by actinomycin D (AMD) (50 ng/ ml) induces a complex segregation of the nucleolar components as observed on cells fixed. In the present work, we addressed the 3D localisation of nucleolar proteins UBF1, UBF2, PAF53, Topoisomerase I, Fibrillarin, Nucleolin and B23 by confocal microscopy within fixed control KB cells and during the action of AMD. Furthermore, we followed the localisation of UBF1, UBF2 and Fibrillarin within living KB cells during the action of AMD. In order to study the complex 3D trajectories of the components containing GFP-UBF and GFP-fibrillarin during the nucleolar segregation, we used both classical visualization tools using (2D + time) modes and developed tools based on (3D + time) visualization procedure. Under action of AMD, the spots labelled by UBF aggregate and form caps localised at the nucleolar periphery. For fibrillarin, the rings observed in control cells evolved into spots under the treatment. Finally, these spots merged to form caps also localized at the nucleolar periphery. This study revealed a different kind of reorganization for both variants of UBF and Fibrillarin upon treatment.
Abstract FR:
Le nucléole est le site de synthèse et de maturation des ARNs ribosomiques. Chez l'homme, les gènes d'ADNr sont répétés et leur transcription est assurée par l'ARN polymérase I, associée à plusieurs facteurs de transcription. Le facteur UBF est présent sous la forme de deux variants, UBF1 et UBF2, produits par épissage alternatif d'un même ARNm. Il est connu que l'inhibition de la synthèse des ARNr par les médicaments anticancéreux comme l'actinomycine D (AMD) se traduit par une importante réorganisation structurale du nucléole. L'objectif du présent travail a été dans un premier temps d'étudier l'organisation des protéines nucléolaires UBF1, UBF2, PAF53, Topo I, fibrillarine, nucléoline et B23 en utilisant des protéines de fusion associées à la GFP. Les résultats obtenus pour les cellules contrôles ont été comparés à ceux obtenus pour des cellules traitées pendant 2 h par 50 ng/ml d'AMD, une concentration inhibant sélectivement l'ARN polymérase I. Le devenir spatio-temporel des chimères GFP-UBF1, UBF2 et fibrillarine a ensuite été étudié grâce à l'utilisation de logiciels (3D + temps), dans des cellules vivantes soumises à l'action de l'AMD. Cette étude révèle un comportement similaire des deux variants d'UBF. Sous l'effet du traitement, les entités marquées se regroupent en un nombre restreint de masses qui se délocalisent à la périphérie nucléolaire. La réorganisation de fibrillarine aboutit également à la formation de coiffes périnucléolaires mais la phase de regroupement des amas, observée également pour UBF, est précédée d'une phase de concentration du marquage. Par ailleurs, les sites contenant les chimères GFP ont été identifiés en microscopie électronique.