Abstract FR:

Ce memoire comporte deux grandes parties consacrees a l'etude de l'influence des heparinoides sur le mecanisme d'inhibition de la cathepsine g leucocytaire humaine (cat g). Dans un premier temps, notre objectif a ete de mesurer les constantes cinetiques decrivant ces mecanismes. Pour cela, une serie d'experiences a ete realisee en presence d'heparine de faible poids moleculaire ( 5,0 kda). Les resultats montrent que cette heparine se fixe sur l'enzyme avec une bonne affinite (k#d = 19 nm) pour former un complexe qui sera lentement inhibe par l'#1-antitrypsine et l'#1-antichymotrypsine. Le meme phenomene est egalement observe avec l'eglin c, un inhibiteur reversible isole chez la sangsue. Dans ce protocole experimental, seule l'enzyme interagit avec l'heparine. Pour chacun de ces inhibiteurs, l'etude cinetique a revele l'existence d'un mecanisme d'inhibition en deux etapes: #e #+ #i # #e#i#* #e#i ou l'enzyme (e) interagit avec l'inhibiteur (i) pour former un intermediaire (ei*) qui s'isomerisera lentement en un complexe stable (ei). L'analyse des constantes cinetiques montre que l'heparine ralentit l'inhibition de la cat g d'un facteur de 12. 000, 10. 000 et 400 pour l'#1-antichymotrypsine, l'eglin c et l'#1-antitrypsine, respectivement. Une autre serie d'experiences est consacree a l'etude des effets des polymeres polyanioniques sur l'activation de l'inhibiteur bronchique (ib). L'ib est un inhibiteur reversible de serines proteases de 11,7 kda localise dans les voies aeriennes. Il ne semble pas jouer un role antiproteasique important au niveau du poumon profond ou sa concentration est dix fois inferieure a celle de l'#1-antitrypsine. Pour les besoins de nos experiences, nous avons utilise des heparines fragmentees de 4,5 kda, 8,1 kda, de 8,0 kda (o-butyrylee, hob), le pentosane sulfate, la chondroitine sulfate type a, b, c, le polyasp et l'acide colominique. L'ib fixe ces polymeres, et les complexes ainsi formes inhibent plus rapidement la chymotrypsine, l'elastase leucocytaire humaine et la cat g. En presence d'heparine, le mecanisme d'inhibition reste de type bimoleculaire dans tous les cas: #e #+ #i # #e#i dans la deuxieme partie de ce memoire, nous avons essaye de localiser les sites de fixation de l'heparine sur la cat g et l'ib. Dans le cas de l'inhibiteur, nous avons realise des experiences de marquage des lysines et des arginines. L'analyse des resultats indique clairement qu'il existe au moins 2 lysines (lys#1#3 et lys#8#7), impliquees dans la liaision avec ce polysaccharide. En ce qui concerne la cat g, nous proposons une structure 3d construite grace aux techniques classiques de modelisation. A partir de cette representation theorique, il apparait que le site actif de l'enzyme est entoure par 5 arginines (arg#2#8#,#7#6#,#8#3#,#1#2#9#,#1#3#3) et 2 lysines (lys#1#7#8#,#1#9#9), susceptibles de lier l'heparine provoquant un encombrement sterique a l'entree du site catalytique