Abstract FR:

L'objet du memoire est le developpement et la mise au point d'une nouvelle technique d'immunodosage simple, sensible et peu couteuse. L'originalite du concept repose sur la detection par voltammetrie a vague carree, de medicaments marques par un systeme redox cationique ou procationique, a l'aide d'une electrode modifiee par un film de nafion jouant le role de capteur electrochimique amplificateur. Le nafion est un polymere polyanionique. Lorsqu'il est depose a la surface d'une electrode, il est capable de preconcentrer par echange d'ions les molecules marquees, et de favoriser ainsi leur detection a des concentrations tres faibles. L'accumulation peut etre effectuee en circuit ouvert si la molecule est cationique, ou en appliquant un potentiel de facon a transformer une molecule procationique en molecule cationique. La methode a ete mise au point pour un immunodosage competitif homogene. Le marquage de plusieurs medicaments amines a ete effectue a partir de trois marqueurs electroactifs modeles: le ferrocene et le nitroxyde, tous deux procationiques, et le cobalticinium, cationique. Nous avons verifie que ces medicaments marques s'accumulent effectivement dans le film de nafion et que les signaux ainsi obtenus sont largement amplifies par rapport a ceux obtenus en l'absence de film. Avant d'appliquer cette technique d'immunodosage a la determination quantitative de medicaments, nous avons du optimiser, avec l'aide d'un medicament marque modele, de nombreux parametres intervenant sur les performances analytiques du capteur. Le plus important d'entre eux fut le procede d'obtention du depot, et c'est grace a la mise au point d'un procede de cuisson bien controle que nous avons pu obtenir des films conduisant a des mesures reproductibles et sensibles. D'autres parametres ont ete etudies tels que l'epaisseur du film, le temps d'accumulation, la rotation de l'electrode, la force ionique, la nature du tampon, les caracteristiques du marqueur lui-meme et plus precisement d u medicament marque, ou encore le potentiel impose, qui influent sur la sensibilite du signal. En parallele, nous avons cherche a montrer si l'analyte, ou bien ses metabolites, ou encore d'autres substances eventuellement presentes dans l'echantillon a analyser, peuvent interferer sur le signal de detection de la molecule marquee. Nous avons ainsi observe que certaines amines hydrophobes, en raison de leur protonation aux ph physiologiques, peuvent inhiber le signal car elles entrent en competition avec la molecule marquee. En derivant la fonction amine par une fonction carboxylate, donc chargee negativement, nous avons supprime l'interference. Enfin, nous avons etudie l'influence eventuelle de la matrice biologique de l'echantillon a doser (serum, urine,. . . ). Il s'est avere que le serum interfere de facon importante sur la detection de molecules marquees au ferrocene ou au nitroxyde, et au contraire, tres faiblement sur les molecules marquees au cobalticinium. Nous avons interprete ce phenomene par l'existence d'une interaction importante entre les proteines du serum et les molecules marquees de types neutre et hydrophobe. L'analyse de l'ensemble des differents resultats, nous a permis de cerner au mieux les limites du systeme. Dans les meilleures conditions d'accumulation, nous avons atteint une limite de detection de 10##9 mol. L##1. Dans une etape suivante, nous avons procede a l'evaluation du principe de la methode en caracterisant l'immunoreactivite des anticorps (specificite, affinite, titre,. . . ) vis-a-vis du medicament marque associe. Puis, de la, nous avons effectue l'immunodosage competitif homogene de differents medicaments a ph physiologique, ce qui nous a permis de tracer leur courbe d'etalonnage, et ainsi de valider le principe de la methode. L'immunodosage de la phenytoine, un anti-epileptique, a ete conduit jusqu'au stade clinique pour le dosage d'echantillons seriques de patients, et les resultats obtenus ont ete compares aux mesures realisees par chromatographie liquide