Regulation of actin polymerization by cell-matrix adhesion complexes : a biochemical study of the talin-vinculin complex
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
To migrate efficiently in different tissues, cells must sense and adapt to variations of the mechanical properties of their environment. In this adaptive process, focal adhesions (FAs) strengthen their link with the extracellular matrix and the actin cytoskeleton. The force-dependent association of the actin binding proteins talin and vinculin could reinforce actin anchoring to FAs by controlling actin assembly though an unknown mechanism. Previous studies showed that vinculin contains a single actin-binding domain (ABD) which binds to actin filaments, caps actin filament barbed-ends and nucleates actin filaments. Talin also contains three ABDs but their ability to regulate actin assembly was not known before this project. The global objective of this PhD project was to determine the precise mechanisms by which the force-dependent talin-vinculin complex controls actin assembly. In a first part of this PhD project, as a prerequisite to the study of the talin-vinculin complex, I finished the characterization of talin. I demonstrated that the N-terminal ABD1 of talin blocks the elongation of actin filament barbed ends observed in fluorescent microscopy (TIRFM), whereas ABD2 and ABD3 do not affect actin dynamics. In the second and main part of this project, I determined the activity of the talin-vinculin complex. Because force is required to trigger vinculin association to talin, and because both proteins are autoinhibited, it has so far been difficult to determine the ability of the talin-vinculin complex to regulate actin polymerization. Therefore, we first designed talin and vinculin mutants that associate constitutively into a stable complex. By combining fluorescence spectroscopy, binding assays and single filament observation in TIRF microscopy, we determined the activities of these mutants and their complex on actin dynamics. Our study first revealed that the three activities of vinculin are controlled by specific auto-inhibitory contacts. We also show that helix deletions along the rod domain of talin expose neighboring vinculin-binding sites, mimicking the mechanical stretching of talin. The binding of these talin and vinculin mutants forms a complex that nucleates filaments capped at their barbed ends. The characterization of a series of complexes, in which vinculin and talin are deleted from various ABDs, reveals the contribution of each protein in this mechanism. Altogether our data suggest a mechanism for the force-dependent reinforcement of actin anchoring in FAs.
Abstract FR:
Pour migrer efficacement dans différents tissus, les cellules doivent détecter et s'adapter aux variations des propriétés mécaniques de leur environnement. Dans ce processus d’adaptation, les adhérences focales (AF) renforcent leur lien avec la matrice extracellulaire et le cytosquelette d'actine. En réponse à la force, l'association de la taline et de la vinculine pourrait renforcer l'ancrage de l'actine aux AF en contrôlant l'assemblage de l'actine par un mécanisme inconnu. Des études antérieures ont montré que la vinculine contient un seul domaine de liaison à l'actine (ABD) qui lie les filaments d’actine, coiffe les extrémités barbées des filaments d’actine et nuclée des filaments d'actine. La taline contient également trois ABD mais leur capacité à réguler l'assemblage de l'actine n'était pas connue avant ce projet. L'objectif global de ce projet de thèse était de déterminer les mécanismes précis par lesquels le complexe taline-vinculine contrôle l'assemblage de l'actine en réponse à la force. Dans une première partie de ce projet de thèse, préalable à l'étude du complexe taline-vinculine, j'ai terminé la caractérisation de la taline. J'ai démontré que le domaine ABD1 de la taline bloque l'allongement des extrémités barbées des filaments d'actine observés en microscopie à fluorescence (TIRFM), alors que ABD2 et ABD3 n'affectent pas la dynamique de l'actine. Dans la deuxième partie de ce projet, j'ai déterminé l'activité du complexe taline-vinculine. Parce que la force est nécessaire pour déclencher l'association de la vinculine à la taline, et parce que les deux protéines sont auto-inhibées, il a jusqu'à présent été difficile de déterminer la capacité du complexe taline-vinculine à réguler la polymérisation de l'actine. Par conséquent, nous avons d'abord conçu des mutants de taline et de vinculine qui s'associent de manière constitutive en un complexe stable. En combinant des études cinétiques en spectroscopie de fluorescence, des tests de liaison à l’actine et l’observation de filaments d’acine uniques en microscopie TIRF, nous avons déterminé les activités de ces mutants et de leurs complexes sur la dynamique de l'actine. Notre étude a d'abord révélé que les trois activités de la vinculine sont contrôlées par des contacts auto-inhibiteurs spécifiques. Nous montrons également que des suppressions d'hélice le long de la taline exposent les sites voisins de liaison à la vinculine, imitant ainsi l'étirement mécanique de la taline. L'association des mutants de taline aux mutants de vinculine forme un complexe qui nuclée des filaments coiffés à leur extrémité barbée. La caractérisation d'une série de complexes, dans lesquels la vinculine et la taline sont amputés de divers ABD, révèle la contribution de chaque protéine dans ce mécanisme. En conclusion, nos données suggèrent un mécanisme pour le renforcement de l'ancrage de l'actine dans les AF en réponse à la force.