UHM-ULM interactions in spliceosomal complexes : structural characterization and targeting with small molecules
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
Gene expression requires many layers ofregulation among which splicing consists in the removalof sequences from primary transcripts. For thisprocess, a macromolecular machinery, the spliceosome,undergoes a dynamic assembly through protein-protein, RNA-RNA and protein-RNA interactionsin a stepwise manner. The simplified view of assemblyof the spliceosome is that first, the ribonucleoproteinU1 snRNP recognizes the 5’ splice site, Splicing Factor1 (SF1) binds the branchpoint sequence andU2snRNP auxiliary factor (U2AF) binds the polypyrimidinetract and 3' splice site (complex E). U2AF assiststhe recruitment of U2 snRNP to the branch point sequenceto form the A complex. Later, the recruitmentof U4/U6-U5 tri-snRNP forges the B complex, uponwhich, structural rearrangements release U1 and U4snRNPs leading to the catalytic C complex. U2AF is aheterodimer, with its 35kDa subunit (U2AF35) boundthrough its U2AF Homology Motif (UHM) domain tothe ULM (UHM Ligand Motif) of the 65kDa subunit(U2AF65). In addition, U2AF65 presents two RNArecognition motifs, a C-terminal UHM and a N-terminalarginine-serine (RS) rich low complexity domain(LCD). In this model, the RS domain of U2AF65 stabilizesthe U2snRNA-branchpoint sequence duplex andthe U2AF65-UHM domain recognizes successively theULM motif of SF1 and several ULMs in the U2snRNPsubunit SF3b155. In vitro, the affinity of U2AF65 forSF1 is relatively better than for SF3b155. LCD are often involved in the formation of condensatesthrough liquid-liquid phase separation (LLPS),which contribute for example to the compartmentalizationof biological molecules in membrane-less organelles.We have previously reported that U2AF65promotes the formation of such condensates viaLLPS. In line with this work, we have characterized theU2AF65 interactions supported by condensates formationrelatively to physicochemical parameters, includingsalt concentration and temperature, as wellas the length of the RS domain and its amino acidcomposition. Furthermore, LLPS can be modulatedby post-translational modifications. We havedemonstrated that the phosphorylation state of theRS domain modulates the formation of U2AF65condensates in vitro. Using pulldown experimentsand immunoprecipitations, we demonstrate thatthe deletion of the RS domain prevents the interactionof U2AF65 with both SF1 and SF3b155, whichstrongly indicates the actual contribution of the RSdomain in UHM-ULM interaction.In parallel, we compared, using nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy, the interactions ofthe hydrophobic core of the U2AF65-UHM domainwith the ULM domains of SF1 and SF3b155. Perturbationsof the 15N-U2AF65-UHM HSQC spectrumindicates that SF3b155 interaction with U2AF65-UHM is supported by at least three ULMs, which isconsistent with previous reports. In agreement, increasingthe stoichiometry of U2AF65-UHM against15N-SF3b155-ULM reveals stepwise changes inchemical shift perturbations of at least three tryptophanresidues, in the SF3b155-ULM spectrum. Interestingly,these HSQC spectra of SF3b155-ULMdid not reveal any structuration upon U2AF65-UHMbinding, suggesting a role of this dynamics to favourthe binding to several ULMs and the formationof U2AF65 condensates in the presence ofSF3b155.Lastly, we initiated a collaboration with the Synsightcompany in order to identify molecules ableto perturbate UHM-ULM interactions. Through insilico analyses, we obtained a small molecule (C13)displaying affinity for U2AF65-UHM as evidenced byNMR analyses. Through NMR and molecular dynamics(MD) simulations, we obtained insights intothe C13 binding mode in the U2AF65-UHM hydrophobicpocket. Using an in vitro binding assay, weshowed that C13 can modulate the binding ofU2AF65 to SF3b155. These promising results suggestthat UHM-ULM interactions could be targetedto fight specific diseases such as cancers.
Abstract FR:
Plusieurs étapes successives sont essentielles àl'expression génique, parmi lesquelles l'élimination de séquencesinternes des transcrits primaires des gènes par lemécanisme d'épissage. Le complexe macromoléculaire quiréalise cette modification des ARN, le spliceosome, est assemblépar étapes par le biais d'interactions protéine-protéine,ARN-ARN et protéine-ARN. D'abord, la ribonucleoprotéineU1snRNP reconnaît le site d'épissage 5', SF1 (SplicingFactor 1) se lie au site de branchement et U2AF(U2snRNP auxilliary factor) au tract de polypyrimidine et ausite 3' (complexe E). U2AF favorise alors l'ancrage deU2snRNP au point de branchement, à la place de SF1, pourformer le complexe A. Ensuite, le recrutement du tri-snRNPU4/U6-U5 conduit au complexe B, et finalement, des réarrangementsstructuraux libèrent U1 et U4 snRNP conduisantau complexe catalytique C. U2AF est un hétérodimère,avec une sous-unité de 35 kDa (U2AF35) liée par son domaineUHM (U2AF Homology Motif) au domaine ULM(UHM Ligand Motif) de la sous-unité de 65 kDa (U2AF65).En outre, U2AF65 présente deux motifs de reconnaissancede l'ARN, un UHM C-terminal et un domaine N-terminal defaible complexité (LCD) riche en arginine-sérine (RS). Dansce modèle, le domaine RS de U2AF65 facilite l'hybridationde U2snRNA au point de branchement et son domaineUHM interagit successivement avec les domaines ULM deSF1 et d'une sous-unité de U2snRNP, SF3b155. In vitro, l'affinitéde U2AF65 pour SF1 est relativement plus élevée quepour SF3b155. Les domaines defaible complexité sont souvent impliqués dans la formationde condensats par séparation de phase liquide-liquide(LLPS), ce qui contribue en particulier à la compartimentalisationde complexes moléculaires dans des organites sansmembrane. Nous avions déjà montré que le domaine RS deU2AF65 favorise la formation de condensats via LLPS. Ici,nous avons recherché les déterminants de ce mécanismeet en particulier la force saline, la température, la longueurdu domaine RS et la composition en acides aminés. Laformation de condensats via LLPS est connue pour êtremodulée par des modifications post-traductionnelles.Nous avons montré que la phosphorylation du domaineRS module la formation de condensats. En utilisant desexpériences de pull-down et des immunoprécipitations,nous démontrons que la délétion du domaine RS empêchel'interaction de U2AF65 à la fois avec SF1 etSF3b155, ce qui indique fortement le rôle du domaine RSdans ces interactions in vivo.En parallèle, nous avons comparé, à l'aide de la spectroscopiepar résonance magnétique nucléaire (RMN), les interactionsdu domaine UHM avec les domaines ULM deSF1 et SF3b155. Les perturbations des spectres HSQC de15N-U2AF65-UHM indiquent que l'interaction de SF3b155avec U2AF65 implique au moins trois ULM distincts, enaccord avec la littérature. Inversement, un dosage de15N-SF3b155-ULM par U2AF65-UHM révèle des perturbationsdes déplacements chimiques d'au moins trois résidustryptophane de SF3b155. Ces spectres HSQC deSF3b155-ULM montrent que ce domaine reste désordonnéen présence de U2AF65, ce qui pourrait faciliter lareconnaissance de plusieurs ULMs et la formation decondensats de U2AF65 en présence de SF3b155.Finalement, nous avons entrepris une collaboration avecla société Synsight afin d'identifier, par criblage in silico,des molécules capables de perturber les interactionsUHM-ULM. Nous avons identifié une petite molécule(C13) interagissant avec le domaine UHM de U2AF65comme le montrent des analyses RMN. La combinaisonde données de RMN et des simulations de dynamiquemoléculaire (MD) a permis d’apporter des informationssur le mode de liaison du C13 dans la poche hydrophobedu UHM. Nous avons également montré que C13 peutmoduler la liaison de U2AF65 à SF3b155. Ces résultatsprometteurs suggèrent que les interactions UHM-ULMpourraient être ciblées pour lutter contre des maladiesspécifiques telles que les cancers.