Découverte de nouvelles molécules antibiotiques et caractérisation de leurs modes d'action
Institution:
université Paris-SaclayDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
Flavonoids are secondary metabolites widespread in plants and belong to a large family of chemical compounds of industrial interest. Flavonoids are an important source of new drugs and nutraceuticals because of their antioxidant, antiviral, antimicrobial, anticancer activities. Our study focuses on the characterization of the antibacterial activity of flavonoids specifically targeting Gram-positive bacteria. The objectives of my research work are i) to establish efficient and rapid screening methodologies to evaluate the antibacterial activity of flavonoids and ii) to determine the mechanisms of action of antibacterial flavonoids. The characterization of the antibacterial activity of flavonoids was carried out with flavonoid toxicity tests against the Gram-positive model bacterium B. subtilis by Live Cell Array method, which measures the bacterial growth kinetics. Several strategies were used to decipher the mode(s) of action of the flavonoids, such as screening a flavonoid library for new compounds active against B. subtilis, screening a collection of B. subtilis mutants for the identification of genes involved in the flavonoid response of B. subtilis, an adaptive laboratory evolution of B. subtilis in presence of flavonoid to obtain and characterize flavonoid-resistant strains, and finally an analysis of the transcriptional response of B. subtilis in the presence of flavonoids. Two flavonoids already identified in the literature to inhibit the growth of Gram-positive bacteria, pinocembrin and naringenin, have antibacterial activity against B. subtilis. A 50% decrease in growth rate was observed in the presence of 93 mg.L ⁻¹ or 32 mg.L ⁻¹ of naringenin or pinocembrin respectively.To decipher the mechanisms of action of the flavonoids, a collection of 63 flavonoids was screened and minimal inhibitory concentrations (MICs) were determined for each flavonoid in the presence of B. subtilis. 17 flavonoids were found to be particularly active against B. subtilis. The attempt to establish a QSAR (quantitative structure activity relationship) model with the 17 active flavonoids was unfortunately not conclusive because, despite obtaining a high quality linear regression (R² ≈ 0.9), cross-validation by using leave-one-out basic method was not obtained. The only plausible explanation for this failure is that the number of modes of action present is too high for a set of 17 compounds, thus rendering the QSAR model obsolete. In a screen of 67 mutants of B. subtilis, eight genes involved in the response to flavonoids (naringenin and pinocembrin) were identified, two of which belong to the LmrA/QdoR regulon, already identified in the literature to respond to flavonoids. The B. subtilis strains ∆lmrA and ∆qdoI are respectively more sensitive and more resistant to naringenin and pinocembrin. The 17 flavonoids previously identified and active against B. subtilis induce a flavonoid-specific transcriptional response according to our analysis of the activity of 10 promoters with the use of transcriptional fusions with a reporter gene. This analysis is consistent with the transcriptomic study carried out for the characterization of the response of B. subtilis in the presence of 5 flavonoids; 2'hydroxyflavanone, bavachine, naringenin, pinocembrin and resokaempferol. Several modes of action of the flavonoids in B. subtilis were identified, involving induction of the stringent response, inhibition of metabolic pathways for cell membrane and cell wall synthesis, and inhibition of central carbon metabolism.
Abstract FR:
Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires largement répandus chez les plantes et appartiennent à une grande famille de composés chimiques d'intérêt industriel. Les flavonoïdes sont une source importante de nouveaux médicaments et nutraceutiques en raison de leurs activités anti-oxydantes, antivirales, antimicrobiennes, anticancéreuses, etc. Notre étude se concentre sur la caractérisation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes ciblant spécifiquement les bactéries à Gram positif. Les objectifs de mon travail de recherche sont i) de mettre en place des méthodologies de cribles efficaces et rapides afin d’évaluer l’activité antibactérienne des flavonoïdes et ii) de déterminer les mécanismes d'action antibactérien des flavonoïdes. La caractérisation de l'activité antibactérienne des flavonoïdes a été réalisée avec des tests de toxicité des flavonoïdes envers la bactérie modèle à Gram positif B. subtilis par la méthode du Live Cell Array permettant d'enregistrer la cinétique de croissance bactérienne en temps réel. Différentes stratégies ont été employées pour décrypter le(s) mode(s) d'action des flavonoïdes ; telles que le crible d'une banque de flavonoïdes pour l'identification de nouveaux composés actifs contre B. subtilis, le crible d'une collection de mutants de B. subtilis pour l'identification de gènes impliqués dans la réponse de B. subtilis aux flavonoïdes, une évolution dirigée en laboratoire de B. subtilis en présence de flavonoïde pour l'obtention et la caractérisation de souches résistantes aux flavonoïdes, et enfin une analyse de la réponse transcriptionnelle de B. subtilis en présence de flavonoïdes. Deux flavonoïdes déjà identifiés dans la littérature pour inhiber la croissance de bactéries à Gram positif, la pinocembrine et la naringénine, ont une activité antibactérienne contre B. subtilis. Une diminution de 50 % du taux de croissance a été observée en présence de 93 mg.L ⁻¹ ou 32 mg.L ⁻¹ de naringénine ou pinocembrine respectivement.Pour décrypter les mécanismes d'action des flavonoïdes, une collection de 63 flavonoïdes a été criblée et les concentrations minimales inhibitrices (MICs) déterminées pour chaque flavonoïde en présence de B. subtilis. 17 flavonoïdes se sont avérés particulièrement actifs contre B. subtilis. La tentative d'établir un modèle QSAR (relation quantitative structure-activité) avec les 17 flavonoïdes actifs n'a malheureusement pas été concluante car malgré l'obtention d'une régression linéaire largement acceptable (R²≈ 0,9), la validation par exclusion systématique d'un composé ("leave one out") n'a pas été obtenue. La seule explication plausible de cet échec est que le nombre de modes d'action présents est trop élevé pour un set de 17 composés, rendant ainsi caduque la modélisation QSAR. Au cours d'un crible de 67 mutants de B. subtilis, huit gènes impliqués dans la réponse aux flavonoïdes (naringénine et pinocembrine) ont été identifiés, dont deux appartiennent au régulon LmrA/QdoR, déjà identifié dans la littérature pour répondre aux flavonoïdes. Les souches B. subtilis ∆lmrA et ∆qdoI sont respectivement plus sensibles et plus résistantes vis-à-vis de la naringénine et de la pinocembrine. Les 17 flavonoïdes précédemment identifiés et actifs envers B. subtilis induisent une réponse transcriptionnelle propre à chacun d'après notre analyse de l'activité de 10 promoteurs avec l'utilisation de fusions transcriptionnelles avec un gène rapporteur. Cette analyse est cohérente avec l'étude transcriptomique menée pour la caractérisation de la réponse de B. subtilis en présence de 5 flavonoïdes ; la 2’hydroxyflavanone, la bavachine, la naringénine, la pinocembrine et le résokaempférol. De ce travail ressort plusieurs modes d'action des flavonoïdes chez B. subtilis, impliquant l'induction de la réponse stringente, l'inhibition de voies métaboliques pour la synthèse des membranes et paroi cellulaires et l'inhibition du métabolisme carboné central.