Développement de thérapies géniques pour les myopathies congénitales
Institution:
Université Paris-Saclay (ComUE)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Congenital myopathies are rare genetic disorders affecting muscles with no curative treatment currently available to patients. They are characterized by hypotonia and generalized muscle weakness often leading to premature death. This group of muscle diseases include a form of nemaline myopathy (NEM3) caused by mutations in the alpha-actin gene (ACTA1) and myotubular myopathy (XLMTM) linked to MTM1, which are associated with the presence of protein aggregates (rods) and centrally located nuclei in skeletal muscle fibers, respectively.During my thesis, I investigated the pathophysiology of NEM3 by analyzing the transcriptome of muscles from a knock-in mouse model of the disease harboring the p.H40Y mutation (KI(Acta1)H40Y). Several deregulated signalling pathways were identified, including pathways that control muscle mass or involved in synaptic transmission. I therefore analyzed the morphology and function of neuromuscular junctions (NMJ) in KI(Acta1)H40Y mice. I found the presence of fragmented NMJ in various muscles, associated with ultrastructural changes in the post-synaptic region, molecular changes and increased fatigability of the diaphragm upon repeated electrophysiological nerve stimulation. These results may pave the way for a pharmacological treatment of NEM3 based on increasing neuromuscular transmission. In parallel, I also explored gene therapy strategies for this disease. Results showed that either intramuscular or systemic administration of recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors expressing ACTA1 under the control of the desmin or cytomegalovirus promoter did not improve the phenotype of KI(Acta1)H40Y mice. Therefore, I developed an allele-specific silencing therapy and selected in vitro siRNA sequences that knock-down efficiently mutated Acta1 transcripts. Intramuscular delivery of rAAV vectors expressing shRNA that target Acta1 mRNA in mutant mice did not ameliorate the patholopical signs of the disease, but rather led to the presence of inflammatory inflitrates in muscles. My results suggest that these gene therapy strategies will have to be further optimized to correct the disease.Apart from that, in the context of myotubular myopathy, I participed to the development of a therapeutic approach aiming at reducing the level of dynamin 2 in muscle cells using antisense oligonucleotides (vivo-morpholinos). Mutations in the dynamin 2 gene (DNM2) have been involved in the autosomic dominant form of centronuclear myopathy and in Charcot-Marie-Tooth disease type DI-CMT2B; in addition, DNM2 overexpression has been implicated in the pathophysiology of myotubular myopathy. We administrated vivo-morpholinos targeting dynamin 2 pre-mRNA intramuscularly in a mouse model of myotubular myopathy (Mtm1-KO) and found that this treatment ameliorated the phenotype, with an increase in muscle fiber size and strength. Therefore, vivo-morpholinos that target human DNM2 pre-mRNA were also generated for potential use in diseases related to dynamin 2 dysfunction.
Abstract FR:
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares touchant les muscles qui ne possèdent pour le moment pas de traitement curatif. Elles se manifestent par une hypotonie et une faiblesse musculaire généralisée pouvant entrainer le décès précoce des patients. Parmi elles, on retrouve la myopathie à némaline (NEM3) causée par des mutations dans le gène de l'alpha-actine (ACTA1) et la myopathie myotubulaire (XLMTM) liée à MTM1, qui se caractérisent respectivement du point de vue histopathologique par la présence d'agrégats protéiques et de noyaux en position centrale dans les fibres musculaires, et dont les mécanismes physiopathologiques sont encore mal connus.Dans ce projet de thèse, j'ai étudié la physiopathologie de la NEM3 grâce à l'analyse du transcriptome des muscles du modèle murin porteur de la mutation p.H40Y dans Acta1 (KI(Acta1)H40Y). Ainsi, plusieurs voies de signalisation ont été révélées comme étant dérégulées, notamment celles contrôlant la masse musculaire et la transmission synaptique. J'ai analysé la morphologie et fonction des jonctions neuromusculaires (JNM) et mis en évidence une fragmentation de celles-ci, associée à des altérations ultrastructurales et moléculaires, et une fatigabilité accrue du muscle mutant lors d'une stimulation nerveuse électrophysiologique répétée, ce qui pourrait ouvrir des perspectives de traitement pharmacologique. Parallèlement, j'ai aussi exploré des stratégies de thérapie génique pour cette myopathie. Mes résultats ont montré que l'administration intramusculaire et intraveineuse de virus adéno-associés recombinants (AAVr) exprimant le transgène ACTA1 sous le promoteur de la desmine ou du cytomégalovirus n'a pas permis d'améliorer le phénotype des souris KI(Acta1)H40Y. Ainsi, j'ai mis au point une autre approche consistant à réduire l'expression de l'ARN messager d'Acta1 et sélectionné in vitro des séquences siARN ayant la meilleure spécificité pour l'allèle muté. L'injection intramusculaire de vecteurs AAV exprimant des shARN ciblant le transcrit d'Acta1 muté chez le modèle murin n'a cependant pas montré de signes d'amélioration de la pathologie, mais plutôt une importante réaction immunitaire. Mes résultats indiquent donc qu'une optimisation de ces stratégies de thérapie génique sera nécessaire pour corriger la maladie.D'autre part, dans le contexte de la myopathie myotubulaire, j'ai participé au développement d'une approche thérapeutique visant à diminuer le niveau d'expression de la dynamine 2 dans les cellules musculaires en utilisant des oligonucléotides antisens (vivo-morpholinos). Des mutations dans le gène de la dynamine 2 (DNM2) sont responsables de la forme autosomique dominante de myopathie centronucléaire et la neuropathie de Charcot-Marie-Tooth de type DI-CMT2B; de plus, la surexpression de DNM2 est impliquée dans le mécanisme physiopathologique de la myopathie myotubulaire. Nous avons montré que l'administration intramusculaire de vivo-morpholinos chez le modèle murin de XLMTM (KO-Mtm1) permet d'améliorer la pathologie, avec une augmentation de la taille des fibres musculaires et de la force. Des vivo-morpholinos ciblant l'ARN pre-messager de DNM2 humain ont donc été générés pour une utilisation potentielle dans le cadre des maladies liées à la dynamine 2.