Parallel Evolution of BiFC for Probing Protein-Protein Interactions in Living Cells
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Abstract EN:
Proteins are crucial for most cellular functions and typically participate in biological processes in concert with other proteins. Hence, identification of key protein players and characterization of protein-protein interactions (PPIs) are highly important. Owing to substantial advances in current biotechnology, a wide range of methods has been developed to dissect the PPI landscape. Given their popularity and power, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay, based on the reconstitution of a fluorescent protein in vivo, has emerged as the most popular protein-fragment complementation method in cellular biology over the past years. My team has previously established BiFC for probing different binary protein interactions in live Drosophila. During my PhD work, I expanded the utility of the BiFC in mammalian live cells. In particular, I standardized the protocol of the BiFC analysis to investigate protein binding affinities, in an applicable and simple manner. This quantitative BiFC approach was used in a systematic analysis of HOX/PBX/MEIS interaction properties in live cells and revealed novel interaction interfaces in several human HOX proteins. Furthermore, I applied the BiFC from low to high throughput PPI detection. Pairing sequence-verified human ORF collections with next generation sequencing, I participated in the conception of a powerful tool for performing a large-scale BiFC interaction screen in live cells. Benefited chiefly from this approach, a synoptic view of comprehensive HOX interactomes was substantially contributed to the current limited knowledge on human HOX protein partners and provided a novel tool in the cell biology arsenal. Along with the contemporary development of proximity labeling methods, in my side project, I depicted and tested a new cell-based PPI detection approach, which combines BiFC and BioID (proximity-dependent biotinylation identification) technologies, and allows deciphering the endogenous interactome of a protein complex. In summary, my PhD work demonstrates that the BiFC is a versatile and powerful approach to study PPIs in the live cellular context, on either small or large scale. In addition, my work further enlarged the potential of BiFC applications by combining it with other tools.
Abstract FR:
Les protéines sont cruciales pour la plupart des fonctions cellulaires et participent généralement aux processus biologiques de concert avec d'autres protéines. L'identification des acteurs protéiques clés et la caractérisation des interactions protéine-protéine (IPP) sont donc très importantes. Grâce aux progrès substantiels de la biotechnologie actuelle, un large éventail de méthodes a été développé pour disséquer le paysage des IPP. Compte tenu de leur popularité et de leur puissance, l'essai par complémentation de fluorescence biomoléculaire (BiFC), basé sur la reconstitution d'une protéine fluorescente, est apparu comme la méthode de complémentation la plus populaire pour analyser les IPP in vivo. Mon équipe a établi la BiFC pour sonder différentes interactions binaires entre protéines dans l’embryon vivant de drosophile. Au cours de mon travail de Thèse, j'ai étendu l'utilité de la BiFC aux cellules vivantes de mammifères. En particulier, j'ai standardisé le protocole de l'analyse BiFC pour étudier les affinités de liaison des protéines, d'une manière simple et applicable. Cette approche quantitative de la BiFC a été utilisée dans une analyse systématique des propriétés d'interaction HOX/PBX/MEIS dans des cellules vivantes et a révélé de nouvelles interfaces d'interaction dans plusieurs protéines HOX humaines. En outre, j'ai appliqué la BiFC de la détection des IPP à haut débit. En jumelant des collections d'ORF humains vérifiés par séquence avec le séquençage de nouvelle génération, j'ai participé à la conception d'un outil puissant permettant de réaliser un écran d'interaction BiFC à grande échelle dans des cellules vivantes. Grâce à cette approche, une vue synoptique des interactomes HOX complets a été réalisée. Ce travail a apporté des perspectives nouvelles sur les propriétés générales d’interaction des protéines HOX tout en fournissant de nouveaux outils permettant désormais des analyses interactomiques comparatives à large échelle. Parallèlement au développement contemporain des méthodes de marquage de proximité, j'ai décrit et testé, dans le cadre de mes projets parallèles, une nouvelle approche pour la détection des IPP au niveau cellulaire, qui combine les technologies BiFC et BioID (identification par biotinylation dépendante de la proximité) et permet de déchiffrer l'interactome endogène d'un complexe protéique. En résumé, mon travail de thèse démontre que la BiFC est un outil polyvalent et puissant pour étudier les IPP dans le contexte cellulaire vivant, à petite ou grande échelle. En combinant la BiFC à d’autres outils, mon travail ouvre également de nouveaux champs d’applications pour le futur. Le test BiFC a montré un potentiel de combinaison avec d'autres méthodes et a largement enrichi l'ensemble des outils en conférant des fonctionnalités améliorées ou nouvelles.