Exploration d’acides ribonucléiques catalytiques et implémentation d’une fonction essentielle dans Escherichia coli
Institution:
Université Paris-Saclay (ComUE)Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
The characterization of an episome able to grow and live only in presence of XNA could be the key to reap part of GMO's benefits with limited environment or health risk. The aim of this work was to explore and implement in E. coli a vital reaction catalyzed by an RNA sequence in order to replace the RNA by XNA at a later stage.In this challenging task, different ribozymes activity were first studied by analytical chemistry technics. Unfortunately, none of the sequences selected using SELEX method demonstrated a catalytic activity with the formation of the expected product.A completely different strategy was set up thereafter to escape the same complications. This time, we chose the suppressor tRNA Cys T' structure and more specifically its variable loop as a scaffold to implement in E.coli a specific RNA sequence vital for the cell. The essential ThyA gene with a mutation at the codon 146 was used to complement the system and screen the tRNA suppressor activity. After several optimizations of the construction, we observed a correct insertion of the different A-Loops in the tRNA Cys T without altering its suppressor function. Finally, implementation of several random sequences was also performed by screening a library.
Abstract FR:
La caractérisation d'un épisome capable de se développer et perdurer uniquement en présence de XNA pourrait être la clé pour profiter des bénéfices des OGM tout en limitant les risques pour la santé et l'environnement. Le but de ce travail était d'explorer et d'implémenter dans E. coli une réaction vitale catalysée par un ARN afin de remplacer par la suite la séquence d'ARN par une séquence de XNA.Dans ce contexte, différentes activités catalysées par des ribozymes ont été étudiées à l'aide de technique de chimie analytique. Malheureusement, aucune des séquences sélectionnées en utilisant la méthode SELEX n'a démontré d'activité fonctionnelle avec la formation du produit attendu.Une approche différente a ensuite été mise en place. Cette fois, nous avons choisi la structure de l'ARNt Cys T suppresseur et plus précisément sa boucle variable comme support pour implémenter dans E. coli une séquence d'ARN spécifique vitale pour la cellule. Le gène essentiel ThyA avec une mutation au niveau du codon 146 a été utilisé pour cribler l'activité de suppression de l'ARNt. Après plusieurs optimisations de la construction, nous avons observé une insertion correcte des différentes boucles A dans l'ARNt Cys T sans altérer sa fonction de suppression. Enfin, l'insertion de séquences aléatoires de différentes tailles a également été mise en œuvre en criblant une banque.