Diminution de l'alloréactivité de cellules T cultivées ex vivo : étude in vitro des mécanismes et effet sur la reconstitution immunitaire in vivo dans un modèle de greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques
Institution:
BesançonDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
We have demonstrated previously that retroviral-mediated transfer of a suicide gene into bone marrow (BM) donor T cells allows an efficient control of graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic BM transplantation. However, 12 days of ex vivo culture is required for the production of sufficient gene-modified cells (GMC). This process requires both CD3 monoclonal antibody (MAb) activation and interleukin-2 (IL-2) expansion resulting in a diminution of expanded cells alloreactivity (termed Co). This phenomena is independent of anergy, clonaI deletion during expansion or apoptosis inducing cell death during mixed lymphocyte reaction. - Here, we demonstrate that this phenomena is the result of T-cell functional exhaustion and not due to anypreferential expansion of regulatory T cells in the culture (Montcuquet N et al. Immunology 2008). - Our approach was then to try to improve the ex vivo culture conditions in order to maintain alloreactivity. Peripheral blood mononuclear cells were activated with soluble CD3 MAb or CD3 and CD28 MAb co-immobilized on beads and expanded for 12 days in the presence of IL-2, IL- 7 or IL-15 before analysis of alloreactivity and phenotype. Replacing the CD3 MAb by CD3/CD28 beads led to similar in vitro alloreactivity but improved also expansion and in vivo alloreactivity of GMC. Replacing the IL-2 with IL- 7, but not IL-15, or decreasing IL-2 or IL- 7 concentrations, improved the in vitro alloreactivity of expanded cells but with lower expansion. Indeed, the alloreactivity of expanded cells was negatively correlated with cell expansion and positively correlated with CD4/CD8 ratio and CD8 expression levels (Mercier-Letondal P, Montcuquet N et al. Cytotherapy 2008). - ln a mouse model of Graft-versus-host Disease (GvHD) induction, memory T-cells are less allogeneic than naïve T cells. Memory T-cells also improve immune reconstitution. We examined the potential of expanded T-cells to improve immune reconstitution in the absence of GvHD. Indeed, expanded splenocytes can have the same effects as fresh memory T-cells. - Taken together these results should be useful in designing GMC therapy protocols where alloreactivity is maintained and co-administrated expanded T-cells offer a new cell therapy product.
Abstract FR:
Une modulation de l'alloréactivité des cellules T présentes dans un greffon de cellules souches hématopoïétiques (CSH) peut être obtenue par transfert par voie rétrovirale d'un gène "suicide" dans les lymphocytes T (LT) du donneur. Le transfert de gène nécessite notamment une période de 12 jours de culture ex vivo de cellules mononucléées (CMN) activées par des anticorps (Acs) CD3 solubles en présence d'Interleukine (IL)-2 qui est en partie responsable d'une diminution de l'alloréactivité des cellules cultivées (appelées Co). Les hypothèses d'induction d'anergie, de délétion des cellules alloréactives au cours de l'expansion ex vivo ou de mort induite par activation au cours de la reconnaissance de l'allo-antigène, testées pour expliquer cette diminution d'alloréactivité, ont été invalidées (résultats non publiés). L'augmentation d'expression de marqueurs des cellules T régulatrices au cours de l'expansion ex vivo nous a incités à tester l'hypothèse selon laquelle une expansion préférentielle des cellules T régulatrices pourrait être à l'origine de la diminution d'alloréactivité des Co. Les résultats obtenus n'ont pas permis de mettre en évidence une activité suppressive liés à la présence de cellules T régulatrices (Montcuquet N et al. Immunology 2008) et suggèrent que la diminution d'alloréactivité résulte d'un épuisement fonctionnel des LT. - Dans un second temps nous avons cherché à améliorer les conditions de culture afin de maintenir cette alloréactivité. L'activation des CMN a été réalisée par des Acs soluble CD3 ou par des Acs CD3 et CD28 co-immobilisés sur billes, puis les cellules ont été cultivées en présence d'IL-2, d'IL-7 ou d'IL-15. Nous avons observé que le fait de remplacer la stimulation CD3 par une co-stimulation CD3/CD28 conduit à une alloréactivité similaire in vitro mais augmente la prolifération cellulaire et l'alloréactivité testée in vivo dans un modèle xénogénique de réaction du greffon contre l'hôte (GvH). Par ailleurs, le fait de remplacer l'IL-2 par l'IL-7 mais pas par l'IL-15, ou de diminuer les concentrations d'IL-2 et d'IL-7 utilisées lors de la culture, améliore l'alloréactivité des Co, au détriment cependant d'une expansion cellulaire plus faible (Mercier-Letondal P et al. Cytotherapy 2008). Ces résultats posent les bases de futurs protocoles de production de cellules T génétiquement modifiées conservant leur alloréactivité en vue d'obtenir un effet anti-leucémique maximal en situation d'allogreffe hématopoïétique. - La culture ex vivo de CMN entraîne non seulement une diminution d'alloréactivité, mais aussi des modifications phénotypiques se traduisant par l'acquisition par les Co d'un phénotype de LT mémoires. Or, les LT mémoires ont une alloréactivité plus faible que des LT naïfs en termes d'induction de GvH mais sont capables d'accélérer la reconstitution immunitaire. Nous avons pu montrer que, de façon similaire, des LT cultivés issus de splénocytes murins étaient capables d'améliorer la reconstitution immunitaire au même titre que des LT mémoires frais dans un modèle murin d'allogreffe de CSH par un effet indépendant de l'alloréactivité. - Ces résultats posent les bases d'un possible développement des LT cultivés comme nouvel outil de thérapie cellulaire permettant d'accélérer la reconstitution immunitaire dans des contextes de greffe où celle-ci est lente (greffe de sang de cordon, greffe haplo-identique. . . ).