Etudes des mécanismes moléculaires de la mobilisation de réplicons du virus de la forêt de Semliki
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The Semliki Forest virus (SFV), an Alphavirus of the Togaviridae family, has a strict and well-characterized cytoplasm replication. Vectors derived from the SFV have showed their effectiveness as a transient system for protein expression or as tools to in vivo deliver vaccine. However, the latter application involves the production of recombinant SFV particles. The clinical use of viral vectors implies the design of safe process, avoiding the emergence of autonomous viral particles. These contaminants occur by recombination between the vector genome and the transcomplementation sequences. To circumvent the recombination problem, it was recently shown that defective recombinant replicons could be mobilized by the means of virus-like particles (VLPs) (Dorange et al. 2004). This mobilization, although effective, is however limited by viral-replicase-induced cytotoxicity. This process is driven by the viral protein nsP2 and by the antiviral innate immune response of the host cells. In this case, the antiviral immunity is induced by the double-stranded RNAs generated at early stage of the viral replication. These double-stranded RNAs activate antiviral proteins, among which the protein kinase RNA-dependent (PKR), the RNAse L, and the IRFs factors (Interferon Regulatory factors). The Activated form of the PKR catalyses the phosphorylation of the initiation factor elF2a, which, in turn, inhibits the translation of the cellular messengers RNAs. The PKR also induces the activation of several cellular pathways : (I) the NF-kB factor cascade, (II) the interferon's pathway. The effector proteins of these pathways trigger the cellular antiviral immunity through a positive feedback. These antiviral reactions interfere negatively during the in vitro production of the recombinant viral particles. The objective of the present study was to determine the internalization mechanism of the recombinant VLPs using a GFP expressing vector (26Sm2) and to optimize the particles production by the targeted inactivation of the antiviral cellular immunity factors. The functional tests have shown that the VLPs entry follows an endocytic pathways, as other VSV-G particles. The effects of innate immunity on VLP production were explored by targeted inactivation, using negative transdominants or interfering RNAs (siRNAs) targeting the PKR or the RNase L, alone or in combination, was consistently improved, leading to higher titers of replicons within transduced cells. In conclusion, we have established that the negative modulation of PKR, IRF3 and RNase L allows to optimize the effectiveness of VLPs derived from the SFV.
Abstract FR:
Le virus de la forêt de Semliki (SFV), Alphavirus de la famille des Togaviridae, possède une réplication cytoplasmique stricte bien caractérisée. Les vecteurs dérivés du SFV ont démontré leur efficacité comme système d'expression transitoire de protéines hétérologues. Cependant, la production de particules recombinantes peut entraîner l'émergence de particules virales autonomes. Ces contaminants surviennent par recombinaison entre les vecteurs et les séquences de transcomplémentation. L'utilisation clinique de vecteurs s'en trouve altérée. Pour contourner le problème de la recombinaison, il a été récemment montré que l'on pouvait mobiliser les particules recombinantes défectives par le truchement de pseudo-particules (Dorange et al. 2004 ; Piver et al. 2006). Cette mobilisation, bien qu'efficace, est cependant limitée par la cytotoxicité des réplicases virales notamment la protéine nsP2 et par la réponse antivirale des cellules hôtes. L'immunité antivirale est induite par les ARNs bicaténaires générés au cours de la réplication virale. Ces ARNs activent les protéines antivirales, principalement la protéine kinase RNA- dépendante (PKR), la protéine RNAse L, et les facteurs IRFs (Interferon Regulatory factors). La protéine PKR activée catalyse la phosphorisation du facteur d'initiation elF2α, qui a un effet négatif sur la traduction des messagers cellulaires. La PKR induit également l'activation de plusieurs voies cellulaires : (i) la voie du facteur NF-kB, (ii) la voie des interférons. Les effecteurs protéiques des différentes voies renforcent par un feedback positif l'immunité cellulaire antivirale. Cette réaction antivirale va constituer un écueil à la production in vitro des particules recombinantes selon les modes décrits par le laboratoire. L'objectif de la présente étude a été de déterminer le mécanisme de l'internalisation des pseudo-particules recombinantes SFV26Sm2 et d'optimiser la production particulaire par l'inactivation ciblée des facteurs de l'immunité cellulaire antivirale. Les tests fonctionnels montrent une entrée des particules par endocytose médiée par la VSV-G. Les voies de l'immunité innée ont été explorées par inactivation à l'aide de transdominants négatifs ou d'ARN interférents. La production de pseudo-particules, en présence des ARN interférentiels dirigés contre les massagers PKR et RNase L, seuls ou en combinaison, ont sensiblement amélioré la mobilisation des réplicons. Afin de déterminer le mode d'action de ces molécules, nous en avons étudié l'influence sur l'expression de la protéine VSV-G. En conclusion, nous avons montré que la modulation négative des protéines PKR, IRF3 et de la RNase L apparaissait intéressante pour optimiser l'efficacité de production des vecteurs dérivés du SFV.