thesis

Développement et évaluation de marqueurs moléculaires adaptés à l'identification d'Echinococcus spp. : application à l'étude de foyers d'échinococcoses kystique et alvéolaire en Europe et en Afrique du Nord

Defense date:

Jan. 1, 2004

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Institution:

Besançon

Disciplines:

Medicine and health

Authors:

Directors:

Abstract EN:

Infectious agents' molecular identification is broadly used for the understanding of evolution, epidemiology or population dynamics of these organisms. Echinococcus granulosus and E. Multilocularis are cestodes involved respectively in cystic echinococcosis (CE) and alveolar echinococcosis (AE), two major human helminths diseases. Strain typing of these parasites is performed to improve the knowledge of the transmission ways which led to the host contamination. Among the techniques proposed to characterize Echinococcus, genetic studies are the most useful. They consist mainly to the comparison of nuclear or mitochondrial fragments DNA. The study of E. Granulosus molecular targets in two important CE foci - North Africa and Eastern Europe - was an essential work for comprehension of parasite circulation because of the multiplicity of the intermediate hosts. After assessment of the relevance of height genetic markers, three of them have been chosen to track E. Granulosus strains in Algeria and Romania. The sheep strain "G1" found in the both countries, has been detected not only in sheep, but also in cattle, and seems responsible of the majority of the human CE cases. The Tasmanian sheep strain "G2", genetically closed to G1, has been found only in Romania. At least, the camel strain "G6" and the pig strain "G7" were involved respectively in Algerian camel and Romanian swine contamination. The sympatric circulation of these strains (G1/G6 in North Africa ; G1/G2/G7 in Romania) offers the oportunity to study putative genetic exchanges and thus help to define their exact taxonomic status. Existence of different genotypes within E. Mu/ti/ocu/aris species is more difficult to detect. Despite epidemiological disparities between AE foci, the parasite, examed with traditional molecular targets, is very homogenous compared to E. Granulosus. Thus, the second part of the thesis was dedicated to the development of tools able to find genetic diversity among E. Multilocularis. Seventeen microsatellite sequences have been isolated and characterized from a genomic DNA library. Three of the more informative have been applied on a panel of E. Mufti/ocu/aris from various geographic and host origine. EmsJ and EmsK microsatellites have allowed to separate the Saint Lawrence Island isolates from the european isolates. Amplification of the EmsB target exhibited complex profiles which correspond to variable repetitions of these fragments in the genome. The identification of several genotypes at the country level, whom the repartition can explain transmission mecanism at very large scale, proves the high discrimative power of this target. The used of such markers could help to understand, with the studies of others biological and ecological factors, the hererogeneity observed between and inside the AE foci. These hypothesis will be tested on the european and the chinese foci, which represented actually high parasite transmission areas.

Abstract FR:

Le suivi de la transmission des agents infectieux par identification moléculaire est désormais largement répandu pour comprendre l'évolution, l'épidémiologie ou la dynamique de population des organismes. Le génotypage des cestodes du genre Echinococcus, parasites circulant parmi des hôtes mammifères, a pour but d'améliorer la connaissance des mécanismes aboutissant à la contamination de ces hôtes et en particulier de l'homme. L'échinococcose kystique (EK) et l'échinococcose alvéolaire (EA) sont causées respectivement par Echinococcus granulosus et E. Multilocularis. De nombreuses méthodes d'analyse du génome de ces deux parasites ont été proposées. Elles reposaient principalement sur l'étude du polymorphisme de séquences d'ADN nucléaire et mitochondrial, définies sur des portions codantes ou non. La première partie de notre travail a consisté à étudier ces marqueurs en Afrique du Nord et en Europe de l'Est, deux foyers d'EK où la multiplicité des hôtes intermédiaires rendait indispensable la caractérisation du parasite. Après une évaluation de huit séquences, trois ont été choisies pour suivre le cheminement des souches d'E. Granulosus en Algérie et en Roumanie. La souche ovine (G1), souche commune aux deux foyers, a été détectée non seulement chez les ovins, mais aussi chez les bovins et semble responsable de la majorité des cas humains. La souche ovine de Tasmanie (G2), très proche génétiquement de G1, n'a été trouvée qu'en Roumanie. Enfin, les souches cameline (G6) et porcine (G7) étaient responsables des lésions prélevées chez les dromadaires et les cochons, respectivement en Algérie et en Roumanie. La découverte de la circulation en sympatrie de ces souches (G1/G6 en Afrique du Nord ; G1/G2/G7 en Roumanie) offre ainsi une opportunité pour observer d'éventuelles recombinaisons génétiques, et par conséquent définir précisément leur statut taxonomique. La distinction de génotypes parmi E. Multilocularis est beaucoup moins évidente. Le parasite, étudié avec les marqueurs traditionnels, se révèle plus homogène qu'E. Granulosus, et ce malgré de grandes disparités épidémiologiques entre les foyers. La deuxième partie de la thèse s'est donc attachée à développer des outils capables de distinguer une variabilité génétique au sein de cette espèce. Dix-sept séquences microsatellites ont été isolées et caractérisées à partir d'une banque d'ADN total. Les trois plus informatives d'entre elles ont été appliquées sur un panel d'isolats d'E. Multilocularis d'origine variée. Les microsatellites EmsJ et EmsK ont permis de distinguer les isolats de l'île Saint Laurent (située dans le détroit de Béring) des isolats européens. L'amplification de la cible EmsB a révélé des profils complexes, qui traduisent le caractère répété de ce microsatellite dans le génome du parasite. L'identification de nombreux génotypes au niveau local (à l'échelle d'un pays), dont la répartition semble définir des micro foyers (quelques centaines de m²), indique le haut pouvoir discriminant de ce microsatellite. L'utilisation de tels marqueurs permettra peut-être d'expliquer l'hétérogénéité épidémiologique observée au sein des foyers d'EA. Ces hypothèses seront testées à la fois sur le foyer européen et sur le foyer chinois, qui représentent actuellement les zones où la transmission du parasite est la plus importante.