Étude structurale des microvaisseaux cérébraux chez la souris au cours du développement périnatal par des approches protéomique et transcriptomique
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Abstract EN:
Neonatal acquired brain lesions have various origins and result in lasting disabilities requiring long term expensive care. Usually identified as cerebral palsy (CP), these disabilities have not decreased in the last two decades, even if neonatal cares underwent improvements. The nature of brain lesions resulting in CP are highly dependent on when the developing brain is exposed to insults and less on insulting event, indicating the determinant part of brain parenchyma and vasculature maturity dependent context. Brain vascular endothelial cells (BEVC) represent an exchange interface between blood and brain. In fact, they support blood brain barrier (BBB) functions: i) physical barrier, ii) transendothelial transport, and iii) metabolic barrier. These functions are assumed by specific protein sets expression in BEVC: i) tight junction (claudins, junction adhesion molecules, occludin) and adherent junction proteins (cadherins, catenins), ii) transporters (solute carriers), and iii) metabolic barrier proteins (enzymes, ATP-binding cassette proteins, multi-drug resistance proteins). BBB functions appear progressively along with development, although permeability is reduced early in fetal life. The roles for vascular reactions in the etiology of lesions likely depend on this "maturity", as highlighted by the high prevalence of intraparenchymal hemorrhages affecting selectively extreme preterms. Previous studies in the laboratory identified differences between neonate and adult BVEC in culture, both at structural and functional levels (energy transport proteins, proteases secretion and glutamate sensitivity). These properties, likely involved in tissue development, may also be responsible for its peculiar vulnerability to environment factors. Other studies in the laboratory showed that five day-old (P5) mice pups were prone to develop hemorrhage while eight day-old pups were resistant in a t-PA inhibitor (PAI-1) knock-out transgenic strain. The aim of this thesis was to characterize factors putatively involved in microvessels vulnerability. In this attempt, we have studied the proteome and the transcriptome dynamic in forebrain microvessels (fMV) from P5 and P10 pups, and adult mice. Indeed, data from the literature allow considering P5 and P10 mice as preterm and full term human neonates surrogates, in terms of cortical maturity. The study has been performed using two independent proteomic and transcriptomic approaches applied to a common biological material: purified fMV from P5, P10 and adult mice. Proteome study was performed using a nanoLC LTC-Orbitrap (Thermo Fischer Scientific) mass spectrometer allowing protein contents analysis (MS/MS) after tryptic digestion. The MS/MS study allowed identification and quantification of 632, 727 and 692 proteins in P5, P10 and adult mice fMV, using Proteome Discoverer® and Progenesis IC-MS® softwares with Mascot® identification based on IPI databank. Fifty-two percent of the 899 unique proteins identified were common to the three ages. The quantitative analysis revealed the highest protein diversity and levels at P10. Protein lists classification by Gene Ontology using KEGG pathways (DAVID online freeware) allowed the identification of pathways significantly over-represented. Although pathways were common at the 3 stages, they exhibit different contents in particular on i) intercellular gap and tight junctions, ii) focal adhesion molecules to basal lamina, iii) basal lamina components and iv) transporters. Gene transcripts dynamic regulations were studied by cRNA hydrization against probes covering whole mouse genome, spotted in Agilent® arrays. Three parallel analyses, each based on cRNA competitive hydrization of from two samples labeled with different fluorochromes, allowed to evaluate expression dynamics (P5-P10, P10-Adult P5-Adult) using the GeneSpring® software. In total, 3197 and 2821 genes exhibited a two-fold minimum up-or down-regulation in at least one comparison. The Gene Ontology study allowed extraction of 92 pathways with significant over-representation in the whole study. Most of those pathways were related to metabolism and signal transmission. Comparisons involving P10 samples exhibited pathways related to cell adhesion. Directed surveys towards BBB (junctions, transport and efflux functions), proteases and glutamate transmission were done manually since mice ontology databanks did not recorded these pathways. Ontology data from proteome and transcriptome studies pointed out a common observation that within pathways detected at all the stages in our study, the unitary elements involved (protein or gene) were largely replaced. This observation was done on basal lamina elements and cell adhesion factors, transport proteins, glutamate transmission, proteases and their inhibitors. Theses data support the hypothesis that the transient vulnerability of microvessels responsible for brain hemorrhages is due to a particular constitution of microenvironment together with a high proteolytic potential, occurring at P5 in mice.
Abstract FR:
Le terme « lésions cérébrales acquises en période périnatale » (LCPP) recouvre un ensemble de lésions cérébrales d'origines et de natures diverses pouvant conduire à des handicaps lourds, qui nécessitent une prise en charge à long terme et coûteuse. La prévalence des LCPP et des handicaps associés n'a pas diminué au cours des vingt dernières années malgré les progrès réalisés dans la prise en charge néonatale. Les LCPP représentent donc un enjeu majeur de Santé Publique. Les fenêtres d'apparition préférentielles des LCPP sont superposables à des phases précises du développement cérébral et de son réseau vasculaire. Les cellules endothéliales vasculaires cérébrales (CEVC) constituent l'interface entre le compartiment sanguin et le parenchyme cérébral. De fait, elles assurent les fonctions de barrière hémato-encéphalique (BHE) : i) barrière physique, ii) transport transendothélial, et iii) barrière métabolique. Le fonctionnement de la BHE dépend de l'expression par les CEVC de protéines spécifiques: i) des jonctions serrées (claudines, junction adhesion molecules, occludine) et adhérentes (cadhérines, caténines), ii) de transport (solute carrier), et iii) induisant une barrière métabolique (enzymes, ATP-binding cassette proteins et multi-drug resistance proteins). Les fonctionnalités de la BHE apparaissent progressivement au cours du développement mais sa perméabilité est limitée tôt pendant le développement foetal. La part des réactions vasculaires dans l'étiologie des LCPP est probablement fonction de cette « maturation », comme l'indique la forte prévalence des hémorragies intra-parenchymateuses chez les extrêmes prématurés. Des études réalisées au laboratoire ont mis en évidence des spécificités des CEVC du souriceau par rapport à celles de la souris adulte tant sur le plan structural (transporteurs de substrats énergétiques) que fonctionnel (sensibilité au glutamate, sécrétion de protéases). Ces propriétés, sans doute impliquées dans le développement tissulaire, pourraient aussi être responsables d'une vulnérabilité spécifique à des facteurs environnementaux. Des travaux du laboratoire ont mis en lumière une prédisposition aux hémorragies cérébrales du souriceau de 5 jours (P5) qui disparaît à 8 jours, dans un modèle transgénique (souris KO pour l'inhibiteur du t-PA). L'objectif de cette thèse a été de caractériser des facteurs pouvant expliquer la fragilité microvasculaire. A cette fin, nous avons étudié le protéome et la dynamique du transcriptome de préparations enrichies de microvaisseaux cérébraux provenant de souriceaux P5, P1 et de souris adultes (Ad). Les données de la littérature nous permettent en effet de considérer les souriceaux P5 et P10 comme des modèles d'études du développement cérébral et vasculaire cérébral d'enfants prématurés ou nés à terme respectivement. L'approche protéomique a été menée au moyen d'un spectromètre de masse de type nanoLC LTQ-Orbitrap (Thermo Fischer Scientific) permettant une analyse du contenu protéique des échantillons biologiques après digestion trypsique. Au total, 632, 727 et 692 protéines ont été identifiées et quantifiées à P5, P10 et chez l'adulte respectivement, au moyen des logiciels Proteome Discoverer® et Progenesis LC-MS® via Mascot et la base IPI. Cinquante-deux pour cent des 899 protéines uniques sont communes aux 3 âges. L'analyse quantitative a mis en évidence une plus grande richesse (diversité et abondance protéiques) à P10. L'étude ontologique (KEGG pathways, DAVID) a permis d'identifier des « pathways » communs dont les constituants diffèrent entre les âges au niveau : i) des protéines de jonctions intercellulaires (jonctions serrées et communicantes), ii) des protéines d'adhésion à la lame basale (jonctions focales), iii) des composants de la lame basale et iv) des transporteurs énergétiques. L'approche transcriptomique repose sur l'hybridation compétitive d'ARN complémentaire contre des sondes représentant le génome complet de Souris, immobilisées sur puces (Agilent). Trois expériences de co-hybridation compétitive d'ARN complémentaires provenant des transcrits à 2 âges, marqués chacun par un fluorochrome différent, ont permis d'évaluer les dynamiques d'expression (P5-P10, P10-Ad et P5-Ad). Le logiciel GeneSpring® a permis d'identifier 3197 et 2821 gènes montrant une régulation positive ou négative respectivement, d'un facteur > 2 dans au moins l'une des comparaisons. L'étude d'ontologie a permis d'extraire 92 « pathways » significativement surreprésentés dans l'ensemble de l'étude transcriptomique. Dans les trois comparaisons, la plupart des « pathways » concerne le métabolisme et la signalisation. Les comparaisons impliquant le stade P10 ont permis d'isoler des « pathways » liés à l'adhésion cellulaire. Des recherches des constituants de la BHE (jonctions, transport et efflux), des protéases et de la signalisation glutamatergique ont été réalisées manuellement pour pallier l'absence de description de ces « pathways » chez la Souris. Les résultats d'ontologie obtenus par les deux approches montrent la substitution progressive des constituants : i) de la lame basale vasculaire et des complexes d'adhésion, ii) des systèmes de transport, iii) de la transmission glutamatergique et iv) des systèmes protéases/inhibiteurs entre jeunes et adultes. Les résultats accréditent l'hypothèse d'une fragilité vasculaire transitoire sous-tendant le risque hémorragique, due à l'immaturité de la lame basale et à un fort potentiel protéolytique endothélial chez la Souris.