Abstract FR:

L'enzyme acétylcholinestérase (AChE) régule la transmission de l'influx nerveux en assurant l'hydrolyse rapide de l'acétylcholine au niveau des synapses cholinergiques centrales et périphériques. Cette fonction est portée par le site catalytique, situé au cœur de la molécule au fond d'une gorge tortueuse et étroite. Cette géométrie particulière, qui semble incompatible avec l'extraordinaire capacité d'hydrolyse de l'AChE, a amené à suggérer l'existence d'une porte arrière permettant une sortie rapide des produits de la réaction d'hydrolyse, la diffusion des molécules d'eau, ou une entrée alternative pour les molécules de substrat. La fonction catalytique de l'AChE peut être régulée de façon allostérique par la liaison d'un ligand au site anionique périphérique (PAS), un site de surface situé à l'entrée de la gorge menant au site catalytique. L'AChE semble par ailleurs jouer un rôle de reconnaissance et d'adhésion cellulaire lors du développement neuronal ou lors des processus de neurodégénérescence observés dans certaines pathologies, comme la maladie d'Alzheimer. Ces fonctions, indépendantes de la fonction catalytique, feraient intervenir des déterminants structuraux localisés en surface de l'enzyme, peut-être au niveau du PAS. Le PAS interviendrait donc dans la régulation allostérique de la fonction catalytique de l'AChE et dans les fonctions non catalytiques supposées de l'AChE. Malgré la quantité considérable d'informations expérimentales disponibles sur l'AChE, les mécanismes moléculaires impliqués dans l'inhibition de l'enzyme suite à la fixation d'un ligand peptidique au PAS ne sont pas encore totalement élucidés. Les déterminants moléculaires impliqués dans les propriétés non catalytiques de l'enzyme ne sont pas encore bien identifiés. Les questions de l'existence, de la topographie et du fonctionnement de la porte arrière restent posées. Nous avons abordé ces questions par une démarche de biologie structurale en utilisant trois anticorps monoclonaux inhibant la fonction catalytique de l'AChE de façon différente. Deux de ces anticorps (Elec403 et Elec410) se fixent au niveau du PAS de manière compétitive à la toxine fasciculine, mais semblent couvrir des zones d'interaction légèrement différentes. Le troisième anticorps (Elec408) ne se fixe pas au PAS mais semble se fixer dans la région de la porte arrière. A partir des informations de mutagenèse dirigée et de compétition d'inhibition obtenues précédemment (Simon et al. 1999), ainsi que de notre propre analyse de la séquence et d'un modèle théorique du Fab403, nous avons modélisé une structure théorique d'un complexe Fab403-AChE, dans lequel le Fab403 fixé au PAS inhibe l'enzyme en bouchant l'entrée de la gorge catalytique, comme le fait la fasciculine. Par ailleurs, nous avons résolu la structure cristallographique d'un complexe Fab410-AChE. Cette structure montre que le Fab410 fixe le PAS de l'AChE de façon différente de la fasciculine et du Fab403, et ne bloque que partiellement l'entrée de la gorge catalytique. Ce modèle et cette structure sont en accord avec les propriétés d'inhibition respectives de ces deux anticorps. Enfin, nous avons résolu la structure cristallographique du Fab408, premier inhibiteur de l'AChE connu pour se fixer dans la région de la porte arrière. Cette structure met en évidence, à l'interface entre les deux chaînes du Fab, une " crevasse aromatique " qui pourrait avoir un rôle prépondérant dans l'interaction du Fab408 avec l'AChE. Cette structure permet déjà de tenter de définir la surface d'interaction sur l'AChE et de modéliser un complexe Fab408-AChE théorique. Obtenir la structure expérimentale d'un complexe Fab408-AChE permettra de confirmer la topographie de ce site régulateur et d'aborder les mécanismes moléculaires de son fonctionnement. Les études effectuées lors de cette thèse contribuent à documenter les mécanismes mis en jeu pour inhiber l'AChE lors de l'interaction d'un ligand peptidique avec un site de surface, PAS ou porte arrière. Accumuler les informations dans ce sens permet aussi de mieux cerner l'ensemble des interactions hétérologues susceptibles d'être mises en jeu lors des fonctions non catalytiques supposées de l'AChE. Les structures obtenues au cours de cette thèse, et celles que nous espérons obtenir ultérieurement (par exemple, celle d'un complexe Fab408-AChE), constituent de nouveaux modèles pour de futures études de relation structure-fonction qui, peut être, permettront la synthèse de nouveaux inhibiteurs hautement spécifiques de l'AChE à usage médical