Modulation de l'activité de la monoxyde d'azote synthétase neuronale (nNOS) dans la région préoptique de l'hypothalamus au cours du cycle oestral : implication dans le contrôle neuroendocrine de la fonction de reproduction
Institution:
Lille 2Disciplines:
Directors:
Abstract EN:
Several lines of evidence suggest that the glutamate induced-nitric oxide (NO) is involved in the neuroendocrine control of reproductive function. We previously showed, by amperometric measurements, that there is an increased NO release concomitant to the preovulatory surge (proestrus 16h) in the hypothalamic preoptic region, containing cell bodies of GnRH neurons, in adult female rats. The aim of this thesis was duplicated: 1. To investigate whether the NO producing enzyme (nNOS) may be modulated during the adult reproductive cycle in the preoptic region and, 2. To determine how NO really acts on GnRH neurons to activate them. Since recent studies demonstrated a physical coupling of the neuronal NO synthase (nNOS) with glutamate NMDA receptor subunit 2B (NR2B) via the scaffolding post-synaptic density protein PSD95. Here we report that the formation of this ternary complex appears to be affected by ovarian hormone levels in nNOS-expressing neurons of the preoptic region during the rat reproductive cycle. Biochemical analysis showed that while nNOS expression remains unchanged, nNOS association to the PSD95/NR2B complex was significantly increased at proestrus (when estrogen levels are highest), and this effect was reproduced following estradiol replacement in ovariectomized rats. The use of a potent estrogen receptor antagonist suppressed the estradiol-induced nNOS/NR2B association in cultured hypothalamic neurons. We further showed that intracranial infusion of a PSD95 antisense oligodeoxynucleotides that disrupts nNOS/NR2B complex in vitro impairs female reproductive cycle. Additional studies revealed that NR2B is coupled to an activated isoform of nNOS (serine-1412-phosphorylated nNOS) at proestrus but not at diestrus. Altogether these results suggest that estrogen-enhanced coupling of nNOS to NR2B and ser-1412 phosphorylation of nNOS are two putative ways to enable a maximal NO release at proestrus and have important influence on hypothalamic reproductive function. The aim of our second study consists to understand the real effect (still enigmatic) of NO on the GnRH neuron activation. By the combination of three technical approaches: electrophysiology, in situ hybridization and primary culture of transgenic mice hypothalamus where GnRH neurons appears green fluorescent by the expression of GFP, we obtained enthusiastic preliminary results. First, electrophysiological tests in whole cell configuration on GnRH-GFP neurons strongly suggests that NO could have a hyperpolarisation effect. Second, GnRH gene expression in different conditions (control, with NMDA plus or without L-NAME a NOS inhibitor and in presence of a NO donor sodium nitroprusside) seems activated by NMDA via NO at the level of protein expression. In situ hybridization experiments are ongoing with the same conditions to confirm at the level of GnRH-mRNA. In third point, we hypothesized that NO could have an effect at the level of synaptic remodeling. We set up a hypothalamic primary culture containing GnRH-GFP cells to study the synaptic contacts by immunocytochemistry where GnRH neurons appear green with pre- and postsynaptic markers show synaptic appositions. Pre-results indicate that the presence of NO could increase the number of synaptic connections on the GnRH neurons. In conclusion, our first completed study shows that two ways of nNOS regulation takes place in presence of estrogens (phosphorylation of Ser-1412 and coupling to NMDA receptor) to stimulates a profound release of NO necessary for the GnRH/LH surge and finally to ovulation. The second part of our work should bring new information about the real NO effect on GnRH neurons activation. Finally, these results lead to a novel concept of the nNOS regulation in thehypothalamus, but also in the entire brain where NO is ubiquitously found.
Abstract FR:
Il est maintenant reconnu que la libération de monoxyde d'azote (NO), en réponse à la stimulation par le glutamate, est impliquée dans le contrôle neuroendocrine de la fonction de reproduction. Nous avons montré en premier lieu, par des mesures ampérométriques, que la libération de NO était augmentée de façon corrélée à la survenue du pic préovulatoire de LH (proestrus 16h), dans la région préoptique hypothalamique qui contient les corps cellulaires des neurones à GnRH. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était double : 1. étudier le mode de régulation de l'enzyme produisant le NO (la nNOS) dans la région préoptique au cours du cycle de reproduction chez l'adulte et, 2. étudier la façon dont peut agir le NO pour activer les neurones à GnRH. De récentes études ont démontré qu'il existait un couplage physique entre la nNOS et la sous-unité 2B (NR2B) du récepteur au glutamate de type NMDA grâce à la protéine d'échafaudage PSD95 au niveau de la densité postsynaptique. Nous montrons dans ce travail que la formation de ce complexe ternaire peut être modulée par les oestrogènes au cours du cycle de reproduction chez la ratte adulte. En effet, nous montrons par des expériences de biochimie, que l'association de la nNOS avec le complexe PSD95/ NR2B est significativement plus élevée l'après-midi du proestrus (au moment où la quantité d'oestrogènes circulants est maximale). Ce mécanisme est également induit chez des rattes ovariectomisées et traitées avec de l'oestradiol. De plus, cet effet de l'oestradiol peut être reproduit dans de cultures primaires de neurones provenant de la région préoptique de rat, et le traitement avec un antagoniste des récepteurs aux oestrogènes bloque cet action. L'infusion intracérébrale d'un oligodésoxynucléotide antisens pour PSD95, qui dissocie le complexe nNOS/ NR2B in vitro, entraîne des perturbations du cycle de reproduction chez les animaux traités. Une autre série d'expériences nous a permis de montrer qu'une forme activée de la nNOS, c'est-à-dire phosphorylée sur la sérine 1412, était couplée à NR2B en proestrus 16h, mais pas en diestrus II 16h, un stade basal du cycle de reproduction. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que le couplage de la nNOS à NR2B induite par les oestrogènes, et sa phosphorylation sur la sérine 1412, représentent deux voies d'activation hypothétiques de la nNOS permettant une libération maximale de NO au moment du proestrus, et modulant donc considérablement la régulation neuroendocrine de la fonction de reproduction. L'objectif de la seconde partie de ce travail de thèse consistait à mieux comprendre l'effet réel du NO sur l'activation des neurones à GnRH. Par trois approches différentes : l'électrophysiologie, l'hybridation in situ et la culture primaire de cellules à partir d'hypothalamus de souris transgéniques où les neurones à GnRH sont vert fluorescent grâce à l'expression de la green fluorescent protein, nous avons déjà obtenu des résultats préliminaires très enthousiasmants. Les tests électrophysiologiques en configuration cellule entière sur les neurones à GnRH-GFP suggèrent fortement que le NO ait un effet hyperpolarisant sur la membrane du neurone à GnRH. Ensuite, l'expression du gène codant pour la GnRH serait activée par le NMDA via la libération de NO. Enfin, nous émettions l'hypothèse que le NO pourrait avoir une action sur la plasticité synaptique autour du neurone à GnRH. Nous avons mis au point une culture primaire contenant des neurones GnRH-GFP permettant de visualiser, par une technique d'immunohistochimie, les contacts synaptiques afférents au neurone à GnRH. Les résultats préliminaires indiquent que la présence de NO pourrait permettre d'accroître le nombre d'appositions présynaptiques sur le neurone à GnRH-GFP en culture. En conclusion, notre première étude, complète, montre que deux voies de régulation de la nNOS sont activées en présence d'oestrogènes (la phosphorylation de la sérine 1412 sur la nNOS et l'interaction de celle-ci avec le récepteur au NMDA) afin de stimuler la libération accrue de NO nécessaire à la survenue du pic préovulatoire de GnRH / LH aboutissant à l'ovulation. La seconde partie de ce travail devrait amener de nouvelles informations quant au rôle effectif du NO sur l'activation des neurones à GnRH. A final, l'ensemble de ce travail amènent de nouvelles données concernant la régulation de l'enzyme nNOS dans l'hypothalamus, mais aussi de façon plus large du fait de la localisation ubiquitaire des neurones libérant du NO dans le cerveau.