Validation d'une technique de chromatographie liquide bi-dimensionnelle pour une étude sur les protéines microsomiales hépatiques et développement de colonnes chromatographiques en silicium mésoporeux
Institution:
BesançonDisciplines:
Directors:
Abstract EN:
This work was carried out within the Département de Physique et de Métrologie des Oscillateurs (L. P. M. O. ) of the institut FEMTO-ST, CNRS UMR 6174, in collaboration with the U. F. R. Des Sciences Médicales et Pharmaceutiques of the Université de Franche-Comté. This PhD has been supervised by Prof essor Lysiane RICHERT and Dr Wilfrid BOIREAU (CNRS Research Scientist). The first part of this thesis was devoted to the design and fabrication of mesoporous silicon chromatographic columns using different clean room techniques (RIE, Cathode sputtering, photolithography. . . ). 1 carried out the various fabrication stages starting from a silicon substrate doped with phosphorus. The colurons characterization was performed using SEM imaging and optical microscopy. A chromatographic separation of two molecules was managed by using silica as stationnary phase. The second part of this work dealt with a Cellular study on Biology and proteomic. The effects of Nafenopine (a peroxisomes proliferator) on the microsomiales proteins of the hepatics cells ofrodents were studied in collaboration with the U. F. R. Des Sciences Médicales et Pharmaceutiques. After the lysis of the hepatic cells of the subjects and the recovery of their microsomiales proteins, the sample was injected into a two-dimensional liquid chromatography device conceived for proteomic, the ProteomeLab PF2D. This apparatus separates proteins according to two types of liquid chromatography: their isoelectric point, by chromatofocusing, as weIl as their hydrophobicity, by RP-HPLC. After differential study of the proteins map, a bio-marker was discovered and identified by Westem Blotting. This is the Cytochrome P450 4Al.
Abstract FR:
Ce travail a été effectué au Département Physique et Métrologie des Oscillateurs (L. P. M. O. ), du laboratoire FEMTO-ST, UMR 6174 du CNRS, en collaboration avec l'U. F. R. Des Sciences Médicales et Pharmaceutiques de l'Université de Franche-Comté. Ces travaux de thèse ont été encadrés par le professeur Lysiane RICHERT et le docteur Wilfrid BOIREAU (Chargé de Recherches au C. N. R. S. ). Des colonnes chromatographiques en silicium mésoporeux ont été conçues et fabriquées. Après avoir appris à utiliser des techniques de salle blanche (RIE, Pulvérisation cathodique, photolithographie. . . ), j'ai procédé aux diverses étapes de fabrication à partir d'un substrat en silicium dopé au phosphore. Leur caractérisation a été effectuée à l'aide de microscopes électroniques à balayage et optiques. Une séparation chromatographique de deux molécules a été réussie en utilisant le pouvoir séparateur de la silice. La deuxième partie de mes travaux de thèse s'inscrit dans le cadre d'une étude de Biologie Cellulaire et de recherches en protéomique. En collaboration avec l'U. F. R. Des Sciences Médicales et Pharmaceutiques, les effets d'un traitement à la Nafénopine (un proliférateur de péroxisomes) sur les protéines microsomiales des cellules hépatiques de rats ont été étudié. Après la lyse des cellules hépatiques des sujets et la récupération des protéines microsomiales, l'échantillon est injecté dans un appareil de chromatographie liquide bidimensionnelle conçu pour la protéomique, le ProteomeLab PF2D. Cet appareil sépare un mélange de protéines suivant deux types de chromatographie liquide; suivant leur point isoélectrique par chromatofocusing et suivant leur hydrophobicité par RP-HPLC. Après étude différentielle des cartes protéiques obtenues, un bio-indicateur a été découvert et identifié par Western Blotting. Il s'agit du Cytochrome P450 4Al.